2022-03-17
NGS測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)中的(de)常規類文庫主要(yao)針對(dui)(dui)全基因組測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)，廣泛應用于各(ge)類物種的(de)重測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)、遺傳(chuan)變異(yi)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)、BSA性狀定(ding)(ding)位、遺傳(chuan)圖譜構建(jian)(jian)、群體(ti)(ti)進化、全基因組關聯(lian)分(fen)析、質粒&線(xian)粒體(ti)(ti)&葉(xie)綠體(ti)(ti)測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)、宏基因組測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)、小(xiao)片段測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)等領(ling)域。NGS測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)涉(she)及提取、建(jian)(jian)庫、上(shang)機多(duo)個(ge)環節，每(mei)一步(bu)都(dou)會影響最(zui)終的(de)數據(ju)質量(liang)。很多(duo)老師在收到(dao)質檢(jian)(jian)報告后(hou)，對(dui)(dui)于DNA質量(liang)的(de)判定(ding)(ding)存(cun)在疑惑。因此，小(xiao)編梳理(li)了(le)整(zheng)個(ge)建(jian)(jian)庫環節中DNA質量(liang)對(dui)(dui)后(hou)續影響的(de)問答，幫助老師更好(hao)的(de)理(li)解DNA與建(jian)(jian)庫結(jie)果的(de)關系。
Q1、常規類文庫的建庫流程。
根據不(bu)同實驗要求，各步(bu)驟相應調整，整體(ti)流程如下：
片段化→純化→末端(duan)修復(fu)&末端(duan)加dA→連接(jie)接(jie)頭→純化→片段分選→擴增→純化→定量→庫檢
Q2、影響建庫成功率的因素有哪些？
主(zhu)要(yao)是DNA的濃度、總量(liang)、純度、完整度等。常規類文(wen)庫(ku)一次(ci)建庫(ku)需要(yao)投入200ng的DNA。如果純度較差或總量(liang)不(bu)足(zu)，就可能會(hui)使最終文(wen)庫(ku)的濃度不(bu)滿足(zu)上機要(yao)求。
Q3、DNA主帶很清晰，并且沒有降解，為什么還會有100bp的小片斷核酸？
提取過程中未去除(chu)徹底的降解或游(you)離的DNA、RNA小片段核酸。
圖一 2號樣品小片段核酸嚴重
Q4、100bp處的小片段核酸會影響后面的建庫上機嗎？需要額外純化嗎？
對(dui)于(yu)常規文庫而言，如(ru)果DNA主帶完整，降解(jie)程(cheng)度(du)不高，不需要額外的純(chun)化，少量小片(pian)段(duan)核酸會(hui)再后續建庫過(guo)程(cheng)中被純(chun)化掉。對(dui)于(yu)一(yi)些特(te)殊文庫，小片(pian)段(duan)核酸可(ke)能會(hui)有(you)一(yi)定的影響，建議去(qu)除。
如果小(xiao)片(pian)段(duan)核(he)酸殘(can)留特(te)別嚴重，DNA的實際濃度會與測(ce)(ce)定濃度偏差(cha)較大(da)，造成(cheng)投入量不準確，且后續建(jian)庫(ku)過程中(zhong)很難將這些小(xiao)片(pian)段(duan)核(he)酸完全純化掉，影(ying)響文庫(ku)的后續質量，進(jin)而影(ying)響測(ce)(ce)序數據(ju)的質量。
Q5、DNA的純度會對建庫上機有什么影響。
DNA提取原樣中的多糖多酚、次生代謝物、各種礦物質或有機物質，都會造成DNA中含有各種雜質。DNA中存在這些雜質就會影響建庫過程中的酶促反應、文庫定量的準確性、下機數據的質量，導致文庫建庫失敗或最終下機數據不理想。這就是為什么如果樣品雜質含量高的(de)情(qing)況下會(hui)建議先(xian)純化再建庫的(de)原因。
圖二1-4號樣品膠孔雜質嚴重
Q6、DNA樣品中存在RNA污染，會影響建庫嗎？
如果樣品中(zhong)存在RNA污染，建議老師做RNA降解的處理(li)。一(yi)(yi)方面，這會(hui)影響實際DNA的濃度(du)；另一(yi)(yi)方面，可(ke)能會(hui)有部分(fen)RNA被連(lian)上接頭并最終測(ce)序(xu)。這樣會(hui)導(dao)致下機數(shu)據(ju)不理(li)想或在過(guo)濾數(shu)據(ju)的時候(hou)造成浪(lang)費。
圖三 1-6號樣品存在RNA污染
Q7、DNA的降解對建庫上機有什么影響？
如果在樣品(pin)(pin)獲(huo)取(qu)、保存、提(ti)取(qu)過(guo)程中處(chu)理不當(dang)可能會使最終得到(dao)的(de)DNA存在一定程度的(de)降(jiang)解。如果DNA存在降(jiang)解，主要在于樣品(pin)(pin)的(de)采集方(fang)式(shi)、保存環境不當(dang)，樣品(pin)(pin)經過(guo)反復(fu)凍(dong)融；也可能是被細胞中自(zi)身存在的(de)的(de)酶降(jiang)解。這種降(jiang)解常帶有(you)序列偏好性，會對后續的(de)下機(ji)數據分析（比如序列拼接等(deng)環節）產生不同程度的(de)影(ying)響(xiang)。
圖四1-3號樣品嚴重降解
Q8、一次建庫需要多少總量的DNA，最低總量多少成功率較高？
不同文庫(ku)的建庫(ku)起(qi)始(shi)量(liang)不同，常規PE文庫(ku)、Metagenome文庫(ku)一(yi)次建庫(ku)起(qi)始(shi)量(liang)要求200ng以上。很多時候由于樣品珍貴，導致實際建庫過程中無法滿足正常起始量的要求，也可以采取風險建庫的方式建庫，通常判斷等級為C等級的樣(yang)品總量雖(sui)然不(bu)滿足正常一(yi)次建(jian)庫(ku)要求但建(jian)庫(ku)成功率(lv)高。
Q9、樣品來源珍貴，總量較少，很難達到常規建庫要求怎么辦？
很多受到來源的限制的樣品DNA總量非常低，推薦構建微量基因組文庫（可(ke)以(yi)參考“微量基因(yin)組建庫方案介紹”，最終數據結果和常規文庫是基本(ben)一(yi)致的）。微量基因組文庫的建庫起始量最低要求為5ng（濃度大于0.5ng/ul，DNA條帶清晰）。小于該總量或電泳檢測結果中無法識別到DNA條帶的樣品可以風險建庫。根據以往建庫結果判斷，如果樣品中確實有提取到的DNA，成功率很高。
綜合(he)上(shang)(shang)述相關問題，可以(yi)發現在(zai)NGS測(ce)序環節中(zhong)，DNA的(de)(de)質(zhi)(zhi)量(liang)會從多(duo)方(fang)面影響最終建(jian)庫成功率、下機(ji)數據的(de)(de)質(zhi)(zhi)量(liang)。這要求(qiu)對不同物種、不同來源的(de)(de)樣品選擇最適合(he)的(de)(de)方(fang)法，從而(er)提取(qu)到(dao)質(zhi)(zhi)量(liang)最佳的(de)(de)DNA。同時(shi)派森諾提取(qu)方(fang)法也在(zai)不斷進行優化中(zhong)，積累(lei)了非常多(duo)的(de)(de)項目經驗(yan)，在(zai)許多(duo)困難(nan)樣本中(zhong)都能獲得質(zhi)(zhi)量(liang)合(he)格滿足上(shang)(shang)機(ji)要求(qiu)的(de)(de)樣品。
圖五 植物--農業作物、薔薇科、杜鵑科等
圖六 臨床樣本--癌組織、血液、細胞
圖七 動物組織--魚類、昆蟲
圖八 細菌/真菌/黏菌
圖九 宏基因組樣本--糞便、土壤、發酵物
另一(yi)方(fang)(fang)面(mian)，對于(yu)來源珍貴或提取(qu)極(ji)為困難的(de)(de)樣品(pin)(pin)，單純從提取(qu)方(fang)(fang)法上很難得(de)(de)到質(zhi)(zhi)量完(wan)全(quan)合格的(de)(de)DNA樣品(pin)(pin)。針(zhen)對這部分樣品(pin)(pin)，需要根據實際DNA的(de)(de)狀(zhuang)態，優化(hua)建(jian)庫(ku)實驗方(fang)(fang)法，盡可能(neng)的(de)(de)將(jiang)這部分樣品(pin)(pin)建(jian)庫(ku)成功，并得(de)(de)到高質(zhi)(zhi)量的(de)(de)測序數據。微量基因組就是(shi)為了滿足這類樣品(pin)(pin)不斷優化(hua)的(de)(de)一(yi)個建(jian)庫(ku)方(fang)(fang)案，這套方(fang)(fang)案已經在非常多的(de)(de)項目中成功建(jian)庫(ku)，詳細比對數據可以參(can)考(kao)之前(qian)公(gong)眾(zhong)號(hao)介紹（微量基因組建(jian)庫(ku)方(fang)(fang)案介紹）。
派森諾多年來積(ji)累了(le)豐富的(de)項目(mu)經驗，根(gen)據不同的(de)物種、組織部位、保存(cun)環(huan)境(jing)，可(ke)以給老師提供全(quan)面、優質(zhi)、高效的(de)NGS測序(xu)支持。
