2022-05-14
在之前(qian)文章推送中，我們(men)對RNA提(ti)取結(jie)果進(jin)行分(fen)析，并對部分(fen)特殊結(jie)果的案例進(jin)行了(le)簡(jian)短的總(zong)結(jie)和展示。雖然小(xiao)伙伴(ban)們(men)已(yi)經(jing)知(zhi)道如(ru)何(he)分(fen)析結(jie)果，也能(neng)(neng)看懂質檢圖，但一直(zhi)以來詢問較(jiao)多的，還是對RNA質量差如(ru)何(he)才能(neng)(neng)繼(ji)續(xu)建庫比較(jiao)感興趣。下面我們(men)就針對RNA質量較(jiao)差的樣(yang)本（樣(yang)品(pin)降解(jie)、DNA污(wu)染(ran)、蛋白污(wu)染(ran)、色(se)素(su)殘留、多糖污(wu)染(ran)、濃度低(di)等）提(ti)供一些思(si)路(lu)。
一、降解的RNA
大多數(shu)RNA是單鏈結構，堿基之間沒有(you)氫鍵，不穩定易降解。除了其(qi)本身(shen)含有(you)豐(feng)富(fu)內源酶的特性外，其(qi)他(ta)外源因素，如樣品制備情況、取樣情況、抽提方法的選擇等(deng)也可能會(hui)導(dao)致RNA的降解。針對降解的RNA主要有(you)以下(xia)3種解決方案。
1.1
原樣有剩余的，可以嘗試提取方法的改變
由(you)于有些樣本組(zu)織結構特(te)殊、代謝產物極(ji)其豐(feng)富，可能會影響到RNA提取(qu)質(zhi)量。另外(wai)，由(you)于RNA酶的(de)廣泛存在并難(nan)以消(xiao)減的(de)頑強特(te)性，使得RNA的(de)抽提純化更為困難(nan)。
1.2
可以再次制備原樣的，需要在制備、收集、保存、運輸等方面更加注意
收(shou)集(ji)樣(yang)品(pin)(pin)時(shi)需保持低溫、無(wu)RNA酶(mei)等(deng)；制備(bei)樣(yang)品(pin)(pin)時(shi)化學、物理等(deng)脅迫的(de)(de)程(cheng)度不(bu)(bu)同可(ke)能(neng)導致(zhi)RNA有不(bu)(bu)同程(cheng)度的(de)(de)降解；短(duan)時(shi)間(jian)內解剖（切(qie)(qie)割，摘取）的(de)(de)組織樣(yang)品(pin)(pin)，其(qi)處理及切(qie)(qie)割過程(cheng)應在冰上盡可(ke)能(neng)快速進行；樣(yang)品(pin)(pin)離開活體或原生(sheng)長環境后，樣(yang)品(pin)(pin)中(zhong)的(de)(de)內源酶(mei)會(hui)開始降解RNA，降解速度與(yu)內源酶(mei)含量及溫度有關。
收(shou)集好的(de)樣(yang)品，應該(gai)立即液氮速凍15min以上，隨(sui)后(hou)-80℃保存，之后(hou)可以用(yong)干冰(bing)寄送。路程較(jiao)遠或運輸時間較(jiao)長的(de)，可適當加大干冰(bing)用(yong)量。從樣(yang)本(ben)收(shou)集到(dao)送樣(yang)最好不(bu)要超過3個月。
1.3
原樣珍貴，難以再次獲取的，可(ke)以嘗試風險(xian)建庫
二、有雜質污染的RNA
針對不同的雜質(zhi)污染類(lei)型，可以(yi)選用不同純化思(si)路，以(yi)下為小(xiao)編總結的幾(ji)種常見的雜質(zhi)污染及解決方法。
2.1
蛋白污染、色素殘留
產生蛋白(bai)(bai)污染(ran)的原(yuan)因可(ke)能(neng)有(you)：1）樣(yang)本本身（如(ru)豆類(lei)，動物(wu)肝臟等）富含蛋白(bai)(bai)；2）取樣(yang)組(zu)織過多或裂(lie)解(jie)液較少，導致裂(lie)解(jie)不充分；3）提取過程中（如(ru)Trizol法）吸(xi)到少量(liang)蛋白(bai)(bai)層等。
色素殘留常與(yu)樣品(pin)的特性有(you)關。甲殼(ke)類(lei)動物、某些昆蟲(chong)的外骨骼、真菌細胞壁(bi)及某些綠藻中含有(you)多糖甲殼(ke)素，是RNA中色素殘留的主要來源。
以(yi)(yi)上情況(kuang)，我們可(ke)以(yi)(yi)利用(yong)磁珠或吸附(fu)柱對RNA再次進行純(chun)化回(hui)收(shou)，經(jing)適當漂洗(xi)，即可(ke)得到較高純(chun)度的RNA。
圖1 膠孔蛋白污染(ran)純化(hua)前后對比
圖2 色素殘留純化前后對比
2.2
DNA污染
有(you)些物(wu)種富含蛋白、多(duo)糖(tang)（如淀粉、當歸(gui)多(duo)糖(tang)、軟骨多(duo)糖(tang)）等(deng)，裂解過程中這些物(wu)質和核酸(suan)一起被釋放(fang)，核酸(suan)易(yi)被這些粘(zhan)稠的物(wu)質包裹，RNA提取中就會出現有(you)DNA污染的情況(kuang)。
我們(men)可(ke)以選用(yong)DNA酶對樣品進行(xing)(xing)DNA消化處(chu)理，之(zhi)后再用(yong)磁(ci)珠或(huo)吸附柱對RNA進行(xing)(xing)回收，并將引入的DNA酶進行(xing)(xing)純(chun)化去除，即可(ke)得到(dao)高純(chun)度RNA。
圖3 DNA污染純化前后對比
2.3
多糖污染
小麥、水(shui)稻種子(zi)、某些(xie)藥用植物根莖的(de)RNA中容易出(chu)現多(duo)糖污染的(de)情況，由于多(duo)糖與核酸的(de)性(xing)質相(xiang)似(si)，所(suo)以(yi)不建議(yi)用純化(hua)的(de)方式進行去除(chu)。派(pai)森諾(nuo)擁(yong)有發明(ming)專利的(de)提取方法，可在前處理階段對(dui)多(duo)糖進行有效的(de)去除(chu)。
圖4 小麥種子RNA膠圖
圖5 水稻種子RNA膠圖
三、濃度低的RNA
3.1
濃度低（檢測有條帶）、體積大、總量相對較高的RNA樣品
我們可(ke)(ke)以(yi)通過(guo)濃縮回收(shou)的(de)(de)(de)方法(fa)來提高(gao)RNA的(de)(de)(de)濃度。常用的(de)(de)(de)方法(fa)還是選用磁珠(zhu)或吸附柱(zhu)對(dui)RNA進行吸附，經(jing)適當漂洗(xi)、晾干后加(jia)入適量的(de)(de)(de)無酶水進行洗(xi)脫。這種方式不僅達到了(le)升(sheng)高(gao)濃度的(de)(de)(de)目(mu)的(de)(de)(de)，而且可(ke)(ke)以(yi)去除(chu)一(yi)部分雜質。下表為經(jing)吸附柱(zhu)濃縮回收(shou)的(de)(de)(de)對(dui)比表，RNA的(de)(de)(de)回收(shou)效率(lv)在(zai)49%及以(yi)上，且純(chun)度更高(gao)，RNA建庫的(de)(de)(de)成功率(lv)也相對(dui)更高(gao)。
表1 RNA濃縮前后對比
另(ling)外，利用(yong)真空離心濃(nong)縮(suo)儀(yi)也(ye)可以對RNA樣(yang)(yang)品(pin)進行濃(nong)縮(suo)，其原理是在真空狀態下溶劑可在低溫中沸(fei)騰蒸發，這種(zhong)方(fang)法雖然能有效(xiao)的(de)(de)(de)提高RNA的(de)(de)(de)濃(nong)度，但樣(yang)(yang)品(pin)中的(de)(de)(de)雜質(zhi)濃(nong)度也(ye)會(hui)隨之升高，且RNA有較大的(de)(de)(de)降解風險，對后續RNA建庫也(ye)會(hui)帶來困(kun)難，所(suo)以一(yi)般(ban)不推薦使(shi)用(yong)。
3.2
濃度低（檢測有條帶）、體積小、總量相對較小的樣品，我們是否可以進行風險建庫或是微量建庫？
很多(duo)受到來源限制的(de)(de)(de)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)，如(ru)醫院的(de)(de)(de)臨(lin)床樣(yang)(yang)本、極端環(huan)境下(xia)樣(yang)(yang)本，此(ci)類樣(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)一般制備困(kun)難、送(song)樣(yang)(yang)量(liang)較少，提取的(de)(de)(de)RNA總(zong)量(liang)低并且質量(liang)較差；還有(you)些樣(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)本身的(de)(de)(de)RNA豐度(du)低，如(ru)動物軟骨組織、脂肪及(ji)眼角膜等；經(jing)脅迫處理的(de)(de)(de)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)一般細(xi)胞狀態較差，mRNA易降解且含量(liang)較少，如(ru)經(jing)高(gao)溫/干旱/高(gao)鹽(yan)處理的(de)(de)(de)植物、細(xi)菌等。以上種(zhong)種(zhong)情況都有(you)可能導(dao)致最終的(de)(de)(de)RNA難以滿足建庫要求。
對于(yu)此類樣品，派森諾有著(zhu)豐富(fu)的(de)建庫經驗，樣品濃度低(di)至4ng/μL的(de)RNA樣品可用于(yu)建庫，建庫成功率接近100%。
3.3
濃度低（檢測無條帶）的RNA樣品
由于瓊脂糖凝膠(jiao)檢測(ce)條件的限(xian)制，RNA條帶(dai)無(wu)法(fa)顯示，使(shi)用安(an)捷倫2100高(gao)靈敏芯片能夠檢測(ce)到核(he)酸(suan)，也可以進行微量建庫。若(ruo)樣品(pin)組織量足夠，可以考慮在提取(qu)階段適(shi)當進行多管合并提取(qu)，以增加(jia)核(he)酸(suan)得(de)率；或考慮在樣品(pin)處(chu)理及收集中是否有處(chu)理不當的地方，優化后再(zai)進行提取(qu)建庫工作。
除(chu)了(le)對以上質量(liang)較(jiao)差RNA的補救(jiu)措(cuo)施外(wai)，某些降解(jie)、濃度總量(liang)低的RNA樣(yang)品，也(ye)可以進行后續的建庫及上機測序。
A、濃度總量(liang)極(ji)低樣本微(wei)量(liang)建庫
針對濃度(du)總量(liang)較低的樣本，推薦微量(liang)轉(zhuan)錄(lu)組(zu)文庫。我們選取部分(fen)樣本進(jin)行結果展示(shi)，圖(tu)6為RNA的瓊脂糖凝膠(jiao)電泳圖(tu)，RNA樣品濃度(du)較低，膠(jiao)圖(tu)上兩條主(zhu)帶清晰，但(dan)亮度(du)微弱。實驗室對其進(jin)行微量(liang)轉(zhuan)錄(lu)組(zu)建庫，qubit文庫濃度(du)在10-15ng/μL之間，labchip質檢結果見圖(tu)11，文庫峰型正常(chang)。
圖6 濃度總量低樣本瓊脂糖凝膠電泳圖
圖7 文庫片段大小labchip檢測結果
將(jiang)(jiang)文庫進行(xing)上(shang)機測序，其中上(shang)機模式為(wei)Novaseq PE150，挑選其中2個樣本的下(xia)機數據(ju)質(zhi)量(liang)進行(xing)統(tong)計(ji)及評估，表2中為(wei)下(xia)機各項數據(ju)統(tong)計(ji)，N(%)及Q30(%)正常(chang)；將(jiang)(jiang)下(xia)機數據(ju)過濾成高(gao)(gao)質(zhi)量(liang)序列后的過濾統(tong)計(ji)見表3，高(gao)(gao)質(zhi)量(liang)序列占比正常(chang)，數據(ju)可(ke)信(xin)度高(gao)(gao)。
表2 下機數據統計
注：Sample：樣品名(ming)；
Reads No.：Reads總數；
Bases(bp)：堿基總數；
Q30 (bp)：堿基(ji)識(shi)別(bie)準確率在99.9%以上的堿基(ji)總數(shu)；
N(%)：模糊(hu)堿基所(suo)占(zhan)百分(fen)比；
Q20(%)：堿(jian)基識(shi)別準確率在99%以上的堿(jian)基所占百分比；
Q30(%)：堿基識別(bie)準確率在99.9%以(yi)上的堿基所占百分(fen)比。
表3 數據過濾統計
注：Sample：樣品名；
Clean Reads No：高(gao)質量序列read數(shu)；
Clean Data (bp)：高(gao)質量序列(lie)堿(jian)基(ji)數；
Clean Reads %：高質(zhi)量序列reads占總reads的百分(fen)比；
Clean Data %：高質量序(xu)列(lie)堿基占(zhan)測序(xu)堿基的百分比。
單堿基(ji)質量分(fen)(fen)布見圖8，大(da)部分(fen)(fen)序列的(de)堿基(ji)質量在(zai)20以上，代(dai)表測序質量較(jiao)好。圖9為(wei)用于評估測序結(jie)果(guo)的(de)均(jun)一性（或是否(fou)有(you)偏(pian)向性）的(de)基(ji)因上測序深度分(fen)(fen)布圖，理(li)想條件下，Reads在(zai)所有(you)表達(da)的(de)基(ji)因上的(de)分(fen)(fen)布應該呈現均(jun)一化分(fen)(fen)布，從圖9上看，基(ji)因覆蓋均(jun)一度均(jun)勻，測序結(jie)果(guo)的(de)偏(pian)向性不強。
圖8 單堿基質量分布圖
注(zhu)：橫坐(zuo)標(biao)是 Reads 中(zhong)(zhong)堿基位(wei)(wei)置（5’->3’），縱坐(zuo)標(biao)是對應位(wei)(wei)點堿基 Q 值(zhi)。紅(hong)線代表(biao)中(zhong)(zhong)位(wei)(wei)數，藍線代表(biao)平均數，黃色區(qu)域代表(biao) 25%-75%區(qu)間(jian)（按(an)照四分位(wei)(wei)數劃分），觸須表(biao)示 10%-90% 區(qu)間(jian)。
圖9 微量轉錄組文庫在基因上測序深度分布
注：橫坐標(biao)為單個基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)堿基(ji)(ji)(ji)(ji)長(chang)度占(zhan)總(zong)堿基(ji)(ji)(ji)(ji)長(chang)度的(de)百分比(bi)(bi)，0表示基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)5'端,100表示基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)3'端；縱坐標(biao)為比(bi)(bi)對(dui)到(dao)所(suo)(suo)(suo)有基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)橫軸(zhou)位(wei)置上(shang)相應區間內的(de)序列(lie)條數的(de)總(zong)和(he)。圖中體現了所(suo)(suo)(suo)有基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)覆蓋情(qing)況(kuang)的(de)疊加結果，曲(qu)(qu)線中每個點的(de)縱坐標(biao)表示所(suo)(suo)(suo)有基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)在該相對(dui)比(bi)(bi)例位(wei)置上(shang)所(suo)(suo)(suo)有序列(lie)的(de)數量；曲(qu)(qu)線反映了測序所(suo)(suo)(suo)得序列(lie)是否在基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)上(shang)均勻分布。若無明顯偏(pian)向鋒，則說明測序無偏(pian)向性。
B、降解類樣本風險建庫
我們可(ke)以(yi)看到(dao)圖10中是(shi)物種為小(xiao)鼠的(de)(de)RNA樣(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)瓊脂糖凝(ning)膠電泳圖及(ji)2100質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)檢(jian)圖（其中1個(ge)），質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)檢(jian)結(jie)果為rRNA的(de)(de)完整性，可(ke)從側面反映mRNA的(de)(de)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)量(liang)。從質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)檢(jian)結(jie)果上(shang)(shang)看，5個(ge)樣(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)總(zong)RNA有不同程度(du)的(de)(de)降解，RIN值在5.5-6.5之(zhi)間。根據不同樣(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)的(de)(de)降解程度(du)，實驗室對該批樣(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)的(de)(de)建庫流程進行優化和調整，文(wen)(wen)(wen)庫濃度(du)及(ji)總(zong)量(liang)結(jie)果見表4；labchip對文(wen)(wen)(wen)庫片段(duan)大小(xiao)進行檢(jian)測，部分結(jie)果如圖11所示，文(wen)(wen)(wen)庫峰(feng)型(xing)正常，可(ke)用于(yu)上(shang)(shang)機測序(xu)。
(a)
(b)
圖10 降解樣本RNA質檢圖
注：(a)降(jiang)解樣(yang)本瓊脂糖凝(ning)膠電泳(yong)圖；(b)安(an)捷倫2100質檢圖
表4 文庫qubit濃度及總量
圖11 文庫片段大小labchip檢測結果
下機(ji)數據(ju)(ju)質量統計見表(biao)5，表(biao)5中為(wei)下機(ji)各項數據(ju)(ju)統計，N(%)及Q30(%)正常(chang)。下機(ji)數據(ju)(ju)Reads平(ping)均(jun)質量分布(bu)見圖12，該圖主要用來(lai)檢測測序(xu)數據(ju)(ju)的平(ping)均(jun)質量分布(bu)情況，從結果(guo)來(lai)看，峰型集中且無前拖(tuo)尾峰表(biao)示測序(xu)數據(ju)(ju)的數據(ju)(ju)質量整體(ti)較好(hao)。另外與參考基因(yin)組(zu)的比(bi)對情況見表(biao)6，總(zong)的基因(yin)組(zu)比(bi)對率在(zai)95.6%及以上(shang)。
表5 下機數據統計
圖12 Reads平均質量分布
注：橫坐(zuo)標表示 reads 的平(ping)均(jun)(jun)質量，縱(zong)坐(zuo)標為對應平(ping)均(jun)(jun)質量值的reads數目。
表6 對比結果統計表
注(zhu)：Sample：樣(yang)品 Clean Reads：用于(yu)比(bi)對的序列總(zong)數
Total Mapped：比(bi)對上參考基(ji)因組的序列總數，百(bai)分比(bi)為 Total Mapped / Clean Reads
Multiple Mapped：比對到多個(ge)位置的序列總數(shu)，百分比為(wei) Multiple Mapped / Total Mapped
Uniquely Mapped：只比對到(dao)一個位置的序列(lie)總數，百分比為(wei) Uniquely Mapped / Total Mapped
