2022-05-12
時至今日，空間(jian)(jian)轉錄組(zu)(zu)已經取(qu)得了(le)極(ji)大的(de)(de)研(yan)究成果，無論(lun)是(shi)10X空間(jian)(jian)轉錄組(zu)(zu)還是(shi)BGI的(de)(de)Stereo-seq，在(zai)研(yan)究組(zu)(zu)織發育圖譜和疾病(bing)方(fang)(fang)面都起(qi)到(dao)了(le)非常(chang)重要的(de)(de)作用(yong)。但是(shi)其(qi)中(zhong)有(you)一(yi)個值得深(shen)思的(de)(de)小缺(que)陷，那(nei)就是(shi)整個空間(jian)(jian)轉錄組(zu)(zu)在(zai)免疫(yi)(yi)組(zu)(zu)庫方(fang)(fang)面的(de)(de)研(yan)究乏善(shan)可陳，一(yi)方(fang)(fang)面是(shi)由于(yu)空間(jian)(jian)轉錄組(zu)(zu)測(ce)到(dao)的(de)(de)是(shi)3’區域，而(er)(er)VDJ的(de)(de)變體結構富集在(zai)5’，另一(yi)方(fang)(fang)面VDJ在(zai)一(yi)個免疫(yi)(yi)細胞(bao)中(zhong)通常(chang)成對出現，而(er)(er)空間(jian)(jian)轉錄組(zu)(zu)的(de)(de)精度(du)目前(qian)均(jun)沒有(you)細胞(bao)級(ji)，10X空間(jian)(jian)轉錄組(zu)(zu)的(de)(de)精度(du)為55um，而(er)(er)Stereo-seq是(shi)納米(mi)級(ji)精度(du)，所以無法像單細胞(bao)一(yi)樣檢測(ce)到(dao)VDJ pairs。盡(jin)管(guan)如此(ci)，還是(shi)有(you)文章和方(fang)(fang)法可以解決這個問題，我們來看(kan)看(kan)空間(jian)(jian)轉錄組(zu)(zu)免疫(yi)(yi)組(zu)(zu)庫的(de)(de)運(yun)用(yong)和方(fang)(fang)法。
應用一：腎細胞癌空間轉錄組BCR的檢測運用
在文章Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer[1]中，發現腎細胞癌三級淋巴結構（TLS）中B細胞成熟亞型和漿細胞的共定位暗示了原位 B 細胞適應性免疫的產生。在此過程中，B 細胞會突變其 B 細胞受體 (BCR) 序列，并選擇和擴增最親和的克隆。為了證明這些事件，有必要研究 BCR 的核苷酸序列。10X Visium 空間技術基于條形碼轉錄本的 RNA 測序，這能夠保留原始轉錄本并執行空間 BCR repertoire 分析，在足夠長度的 mRNA 轉錄物捕獲大多數 IGL 和一些 IGH 序列的完整互補決定區 (CDR)3 區域。在包含TLS區域的腫瘤中發現了最多的獨特克隆型和總 Ig 計數。在 TLS 區域也發現了數量最多的獨特鏈克隆型。通過測量 Ig 輕鏈序列的 V 區的突變計數與映射的 V 種系基因進行比較來評估 B 細胞成熟。并且值得關注的是，在腫瘤區域中遠離 TLS 的大部分是高度突變的序列。盡管如此，在 TLS 區域研究了全部的突變序列，包括高度突變的序列，而距 TLS 一定距離的大多數 Ig 轉錄物富含高度突變的序列，表明體細胞超突變發生在 TLS 中，并表明突變的 PC 在整個腫瘤中遷移。
圖(tu)1 每個spot的(de)獨特 IGL 克隆型平(ping)均數(shu)量(liang)和平(ping)均 VL 突(tu)變計數(shu)的(de)空間分布(bu)
為(wei)了(le)確定擴增的(de)(de) IgH 克(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)型(xing)的(de)(de)克(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)關系和位置，對 30 個 RNA-seq 空間數據進(jin)行了(le)克(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)性評(ping)估。克(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)性由相(xiang)(xiang)(xiang)同(tong)的(de)(de) VH 基因(yin)(yin)家族(zu)、相(xiang)(xiang)(xiang)同(tong)的(de)(de) JH 基因(yin)(yin)和相(xiang)(xiang)(xiang)同(tong)的(de)(de) CDR3 長度以及 VH 序(xu)列之間的(de)(de) CDR3 核苷酸(suan)序(xu)列的(de)(de)最大差(cha)異為(wei) 15% 來定義(yi)。為(wei)了(le)可(ke)視(shi)化這些(xie)關系，計(ji)算(suan)了(le)每(mei)個 VH CDR3 序(xu)列之間的(de)(de) Levenshtein 距離，并用 TLS+ 腫瘤的(de)(de)圓形樹表(biao)示它。IgH 克(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)型(xing)在(zai) Visium slide 上(shang)的(de)(de)定位證明(ming)(ming)了(le)同(tong)一家族(zu)的(de)(de)克(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)型(xing)聚集在(zai) TLS 附近(jin)并在(zai)遠(yuan)處稀疏遷(qian)移。一些(xie)克(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)型(xing)甚至可(ke)以在(zai)距它們所在(zai)的(de)(de) TLS 區(qu)域高達 3 mm 處檢測(ce)到(dao)可(ke)能已經生成。此外，這些(xie)克(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)型(xing)位于 TLS 內部(bu)和遠(yuan)離 TLS 的(de)(de)位置，表(biao)明(ming)(ming)相(xiang)(xiang)(xiang)應(ying) B 細胞(bao)克(ke)(ke)(ke)隆(long)(long)的(de)(de)遷(qian)移。
圖2 IGH克隆型的聚類分析與空間定位
應用二、癌癥空間轉錄組TCR的檢測運用
空間轉錄組學允許在不影響空間信息的情況下測量基因表達，從而判斷細胞的空間分布與相互作用，其中，免疫細胞與腫瘤細胞的相互作用顯得尤為重要，對適應性免疫過程的詳細了解需要確定 B 和 T 細胞受體序列，這些序列決定了淋巴細胞抗原的特異性，并可以作為淋巴細胞克隆的條形碼。抗原受體測序已經改變了 B 和 T 細胞的單細胞研究，于是在文章Localization of T cell clonotypes using spatial transcriptomics[2]中提出了一種從 10X Genomics 的商用 Visium 空間基因表達平臺確定 T 細胞受體 (TCR) 序列的方法。技術允許同時可視化 T 細胞受體克隆型和組織內的整體基因表達。
圖3 TRB序列的空間分布
借助空(kong)間(jian)TCR克隆的空(kong)間(jian)分布研究，可(ke)揭示(shi)浸(jin)潤(run)腫瘤組織的免疫(yi)細胞的VDJ pairs，意義(yi)重大(da)，甚至可(ke)指導臨床(chuang)運用，如果通過體外培養具(ju)有浸(jin)潤(run)腫瘤的免疫(yi)細胞（擁(yong)有超突(tu)變的VDJ pairs）作為靶(ba)向(xiang)治療，相(xiang)信可(ke)以攻克腫瘤難關。
空間VDJ檢測的分析原理
下圖為空間(jian)VDJ文庫(ku)構建示意(yi)圖：
圖4 空間VDJ文庫構建示意圖
最(zui)為(wei)核(he)心的(de)(de)部(bu)(bu)位(wei)就是類似(si)于(yu)單細胞進行(xing)5’VDJ區域的(de)(de)富集，從(cong)而達到空(kong)間(jian)(jian)(jian)檢測(ce)CDJ的(de)(de)目的(de)(de)。Visium 空(kong)間(jian)(jian)(jian)轉(zhuan)錄(lu)組學平臺(tai)使(shi)用載玻片結合(he)的(de)(de)單鏈 DNA 探針來捕獲(huo)多(duo)腺苷(gan)酸化的(de)(de) mRNA。每(mei)個(ge)探針在 5' 端包(bao)(bao)含部(bu)(bu)分(fen) Read 1 序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)、16 個(ge)核(he)苷(gan)酸的(de)(de)空(kong)間(jian)(jian)(jian)條形(xing)碼(ma)、12 個(ge)核(he)苷(gan)酸的(de)(de)唯一分(fen)子標識符 (UMI) 和 3' poly(dT) 尾。最(zui)初使(shi)用 read 1 引物序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)對于(yu) cDNA 擴增，空(kong)間(jian)(jian)(jian)條形(xing)碼(ma)將探針連接到特定的(de)(de)空(kong)間(jian)(jian)(jian)位(wei)置(zhi)，UMI 識別第一鏈合(he)成(cheng)過(guo)程中產生的(de)(de)獨(du)特 cDNA 分(fen)子。在成(cheng)像和組織透化后，多(duo)腺苷(gan)酸化的(de)(de) RNA 分(fen)子與 poly(dT) 尾部(bu)(bu)退火(huo)，允(yun)許隨后的(de)(de)逆轉(zhuan)錄(lu)以(yi)擴展 ssDNA 探針以(yi)包(bao)(bao)含 cDNA 序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)和添加的(de)(de)模(mo)板(ban)轉(zhuan)換(huan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)。第二條鏈是用與模(mo)板(ban)轉(zhuan)換(huan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)互補的(de)(de)引物產生的(de)(de)；通過(guo)添加氫氧化鉀(jia)從(cong)載玻片上(shang)洗脫這條全長的(de)(de)第二條鏈。該洗脫的(de)(de)第二條鏈被擴增以(yi)生成(cheng)全長 cDNA 文(wen)庫，該文(wen)庫具有空(kong)間(jian)(jian)(jian)條形(xing)碼(ma)和 UMI，位(wei)于(yu) poly(A) 尾的(de)(de) 3' 端。
為了生成包含 TCRβ 的 CDR3 區域以及 UMI 和包含位置信息的空間條形碼的 cDNA 分子，TCRβ 擴增必須在 TCR 的 5' 端使用引物進行。由于 TCRβ 恒定區位于 CDR3 的 3' 端，因此需要一組可變 (TRBV) 基因引物來生成包含 CDR3 和空間信息的 cDNA 分子。使用來自 Visium 測定的擴增 cDNA 作為模板，使用該修飾的 TRBV 引物池和 Read 1 引物進行 PCR，以生成富含 TCR 的文庫。雖然標準的 Visium 基因表達方案要求對 cDNA 文庫進行片段化，但 此處生成的富含 TCR 的庫不能在不丟失 TCR 和空間條形碼序列之間的聯系的情況下進行分段。因此，富含 TCR 的 cDNA 文庫通過珠子純化進行純化，并直接進行樣本index PCR 以進行雙端測序。
雙(shuang)端測(ce)序的read 1 必須執行至少 28 個PCR循環，以(yi)提供 16 核(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)空(kong)間(jian)條(tiao)形碼和 12 核(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan) UMI 的序列(lie)。read 2 包含 TCRβ 識(shi)別 CDR3 序列(lie)，最好(hao)長于(yu) 100 個核(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)。在當(dang)前的研(yan)究中，在 Illumina MiSeq 儀器(qi)上進行了讀取長度(du)≥150 個核(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)(suan)(suan)的雙(shuang)端測(ce)序。為(wei)了分析，read 2 經受 MiXCR pipeline以(yi)識(shi)別存在的 TCR 和支持每個識(shi)別的 TCR 序列(lie)的read。從配對read 1 中識(shi)別出 UMI 和空(kong)間(jian)條(tiao)形碼，以(yi)校正(zheng)擴增偏差并將 TCR 與空(kong)間(jian)位置匹配。
空間VDJ的重要意義
空間VDJ的(de)(de)研(yan)究絕不僅(jin)僅(jin)是提供了(le)VDJ序列(lie)在空間上的(de)(de)分(fen)布(bu)(bu)位置，更(geng)多的(de)(de)是在不同的(de)(de)空間條件下，VDJ分(fen)布(bu)(bu)蘊含的(de)(de)重要生物(wu)學意(yi)義(yi)。B細(xi)胞IGH超突變的(de)(de)遷移和浸潤，為癌癥(zheng)的(de)(de)免(mian)(mian)疫治(zhi)療提供了(le)新的(de)(de)契機，也充(chong)分(fen)認識到免(mian)(mian)疫細(xi)胞的(de)(de)遷移之伴(ban)隨著其他細(xi)胞類型的(de)(de)輔助完成的(de)(de)。T細(xi)胞VDJ序列(lie)的(de)(de)空間分(fen)布(bu)(bu)，尤其浸潤腫瘤組織(zhi)的(de)(de)對(dui)腫瘤細(xi)胞的(de)(de)殺(sha)傷(shang)作(zuo)用(yong)(yong)，對(dui)臨(lin)床研(yan)究有(you)重大意(yi)義(yi)。總之，空間免(mian)(mian)疫組庫是一個全(quan)新的(de)(de)技術領(ling)域，未來一定(ding)會在生物(wu)學研(yan)究、臨(lin)床應用(yong)(yong)方(fang)面發揮(hui)巨大的(de)(de)作(zuo)用(yong)(yong)。
[1]Maxime Meylan, Florent Petitprez, et al. Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer. Immunity. 55, 1–15.
[2]WH Hudson，LJ Sudmeier,et al. Localization of T cell clonotypes using spatial transcriptomics.biorxiv
