2022-06-16
毫無疑問(wen)(wen)多(duo)(duo)組(zu)(zu)(zu)學(xue)(xue)(xue)聯(lian)合的(de)(de)(de)(de)實(shi)驗設計對(dui)于解(jie)(jie)析生(sheng)物學(xue)(xue)(xue)問(wen)(wen)題(ti)(ti)是(shi)(shi)十分有效且敏感的(de)(de)(de)(de)。相對(dui)于單(dan)組(zu)(zu)(zu)學(xue)(xue)(xue)來(lai)說，起到的(de)(de)(de)(de)是(shi)(shi)1+1>2的(de)(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)。多(duo)(duo)組(zu)(zu)(zu)學(xue)(xue)(xue)就像是(shi)(shi)一條河流(liu)，從(cong)最初的(de)(de)(de)(de)DNA（基因組(zu)(zu)(zu)）到轉錄(lu)水(shui)平（轉錄(lu)組(zu)(zu)(zu)）以及解(jie)(jie)析來(lai)進行(xing)翻譯（蛋白(bai)組(zu)(zu)(zu)），以及下游對(dui)于代謝物質的(de)(de)(de)(de)研究(jiu)(jiu)（代謝組(zu)(zu)(zu)）。同時還有多(duo)(duo)種(zhong)(zhong)表(biao)(biao)觀(guan)修飾發揮作(zuo)用(yong)（表(biao)(biao)觀(guan)組(zu)(zu)(zu)學(xue)(xue)(xue)），不同的(de)(de)(de)(de)外部微生(sheng)物環(huan)境也會造成差(cha)異（微生(sheng)物組(zu)(zu)(zu)）。從(cong)變異或者表(biao)(biao)達水(shui)平單(dan)方面(mian)去解(jie)(jie)析生(sheng)物學(xue)(xue)(xue)問(wen)(wen)題(ti)(ti)，毫無疑問(wen)(wen)在當(dang)今的(de)(de)(de)(de)研究(jiu)(jiu)中是(shi)(shi)較為乏力的(de)(de)(de)(de)。多(duo)(duo)組(zu)(zu)(zu)學(xue)(xue)(xue)可以從(cong)多(duo)(duo)個方面(mian)來(lai)解(jie)(jie)析問(wen)(wen)題(ti)(ti)，并且多(duo)(duo)種(zhong)(zhong)組(zu)(zu)(zu)學(xue)(xue)(xue)可以互相驗證，在挖掘調控網(wang)絡、研究(jiu)(jiu)分子功能都(dou)可以起到很大的(de)(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)。
對于當今(jin)火(huo)熱的單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)領域來(lai)說，除了單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)組學間的互相(xiang)聯合(he)分(fen)(fen)析（如scATAC、scRNA聯合(he)分(fen)(fen)析；scRNA、空轉聯合(he)分(fen)(fen)析）之外，結合(he)單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)和其他組學研(yan)究(jiu)能碰撞出怎樣(yang)的火(huo)花呢？今(jin)天給大(da)家(jia)分(fen)(fen)享一篇結合(he)了scRNA、scATAC、EQTL（基因組、轉錄組）等組學的研(yan)究(jiu)文章。
2021年，賓夕法(fa)尼亞大學(xue)腎臟(zang)電解質和(he)高血壓科(ke)等(deng)基構在《Nature Genetics》上發表(biao)論文《Mapping the genetic architecture of human traits to cell types in the kidney identifies mechanisms of disease and potential treatments》。
開(kai)篇明義，作者(zhe)介紹到(dao)慢(man)性(xing)(xing)腎病（CKD）影(ying)響(xiang)著(zhu)全球八億多人，全球每60人死亡其(qi)中就(jiu)有1人患有腎病。所(suo)以了(le)解慢(man)性(xing)(xing)腎病遺傳學的(de)(de)特征是(shi)十分關鍵的(de)(de)。當(dang)前(qian)的(de)(de)研究中，基(ji)于(yu)大(da)隊列的(de)(de)GWAS發現了(le)約(yue)300個位點與腎功能具有統計學意(yi)義的(de)(de)相關性(xing)(xing)。然而，解析這些(xie)位點的(de)(de)功能影(ying)響(xiang)還是(shi)十分困難的(de)(de)。首先，目前(qian)尚(shang)不清楚這些(xie)變異在哪種細胞類型中是(shi)活躍的(de)(de)，以及它(ta)們(men)如(ru)何影(ying)響(xiang)特定(ding)的(de)(de)生物途徑。另(ling)外就(jiu)是(shi)超過90%的(de)(de)主要相關變異位于(yu)基(ji)因組的(de)(de)非編碼區，使CKD風險靶(ba)基(ji)因的(de)(de)精(jing)確(que)識別更加困難。
當前將定(ding)位變異到致病基(ji)因的(de)常用方法(fa)就是利用eqtl，同時結合表觀遺傳學的(de)方法(fa)來(lai)分析重要的(de)基(ji)因功(gong)能(neng)調控(kong)區域。作者在這(zhe)篇(pian)文章中，結合了多(duo)種單細(xi)胞測(ce)序方法(fa)，將細(xi)胞類型(xing)，變異，基(ji)因功(gong)能(neng)進行(xing)了整合分析以試圖解(jie)析復(fu)雜的(de)腎臟疾病相關(guan)表型(xing)。
接下來我們來看下作者的分析方法與主要結論。
一：利用scRNA-seq解(jie)析人腎樣本的細(xi)胞分數，并且鑒定eQTL(cf) eGenes
作(zuo)者(zhe)一(yi)共收(shou)集了(le)(le)659個(ge)(ge)樣(yang)本(ben)，為了(le)(le)減少細胞的異質性(xing)，作(zuo)者(zhe)將每個(ge)(ge)組織樣(yang)本(ben)顯微解剖到腎(shen)小(xiao)球(qiu)和(he)(he)小(xiao)管隔間(jian)，對這并659個(ge)(ge)樣(yang)本(ben)(356個(ge)(ge)小(xiao)管和(he)(he)303個(ge)(ge)腎(shen)小(xiao)球(qiu))進行(xing)rna測(ce)序和(he)(he)基因分型。基于常規的EQTL分析(xi)，作(zuo)者(zhe)在小(xiao)管和(he)(he)腎(shen)小(xiao)球(qiu)樣(yang)本(ben)中分別發(fa)現了(le)(le)3599和(he)(he)5871個(ge)(ge)eGenes（該基因與(yu)具有顯著P值的SNP相關(guan)）。
接下來作(zuo)者(zhe)提出(chu)解(jie)析(xi)每個樣(yang)本的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)群分布可以(yi)提高eQTL信息(xi)的(de)質量(liang)，作(zuo)者(zhe)首先對但(dan)腎單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)數據集進行(xing)(xing)分析(xi)并且定義出(chu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型，基(ji)(ji)于這(zhe)些(xie)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型與表達對bulk RNA-seq進行(xing)(xing)反卷(juan)積（CIBERSORTx方法）分析(xi)。與預期的(de)一(yi)樣(yang)，近端小(xiao)管(PT)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)是(shi)顯微解(jie)剖小(xiao)管腔(qiang)室中最常(chang)見(jian)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型，腎小(xiao)球內皮細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)是(shi)腎小(xiao)球細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)主要細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型。作(zuo)者(zhe)也注意到PT細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分數與估計的(de)免(mian)疫細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分數和(he)腎纖維(wei)化呈負相關。加入細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分數（cell fraction）之后，eGenes的(de)數量(liang)在腎小(xiao)管和(he)腎小(xiao)球中分別增加了(le)28%（1256個基(ji)(ji)因）和(he)18%（1194個基(ji)(ji)因）。
使用eQTL細胞(bao)分(fen)數(shu)的eQTL(cf)模型，即將(jiang)樣本細胞(bao)分(fen)數(shu)作為協變(bian)量(liang)因(yin)(yin)子，通過表達(da)式殘差(PEER)因(yin)(yin)子的概率(lv)估計來估計潛在變(bian)量(liang)的調整。該分(fen)析分(fen)別在小管和腎小球樣本中鑒(jian)定(ding)出(chu)9209和10106個egenes，其中6821和7501個蛋(dan)白編碼(ma)基(ji)因(yin)(yin)，865410和897548個顯(xian)著snp基(ji)因(yin)(yin)對(dui)。
作者發現(xian)基于eQTL(cf) 模(mo)(mo)型發現(xian)的(de)(de)egenes相(xiang)較于之(zhi)前具有兩倍(bei)的(de)(de)數量。一些之(zhi)前沒有發現(xian)的(de)(de)基因，如SANBR/KIAA1841和MRPL43在(zai)之(zhi)前的(de)(de)eQTL分析中沒有顯著相(xiang)關性，但在(zai)eQTL(cf)模(mo)(mo)型中卻顯示出了(le)顯著的(de)(de)相(xiang)關性。并且該模(mo)(mo)型發掘的(de)(de)egenes與之(zhi)前報道(dao)的(de)(de)SNP-GENES配對(dui)也有很好的(de)(de)重(zhong)復性。
作(zuo)者發現在(zai)625個（編碼功能缺失）腎(shen)病基因(yin)中，有303個被鑒定為(wei)eGenes。GO分(fen)析(xi)(xi)表(biao)明，eGenes在(zai)代(dai)謝(xie)過(guo)程中富集(ji)，包括小分(fen)子和碳水化合物衍生物的代(dai)謝(xie)過(guo)程。對發表(biao)的GTEx數據中48個組織的meta分(fen)析(xi)(xi)顯示，與(yu)eQTL(cf)研究中存在(zai)大(da)量的共享(xiang)基因(yin)，同時(shi)還包括1309個小管(guan)特異性和1458個腎(shen)小球特異性egenes(M>0.9)。
二(er)、接下來既然已經(jing)知(zhi)道每個(ge)樣(yang)本的細胞成分，那(nei)么作者就關注到(dao)那(nei)些與(yu)細胞類型相(xiang)關的eqtl
細胞類型(xing)(xing)(xing)相(xiang)互(hu)作用的eQTL(eQTL(ci))，以細胞類型(xing)(xing)(xing)依賴的方式調節基因(yin)表達，作者進行了線性回歸(gui)分析(xi)，模擬了細胞分數和基因(yin)型(xing)(xing)(xing)之(zhi)間的相(xiang)互(hu)作用。
作者(zhe)(zhe)在(zai)腎(shen)小(xiao)管和(he)腎(shen)小(xiao)球樣本中(zhong)分(fen)別鑒定出(chu)1613個和(he)713個蛋白編碼eQTL(ci)基(ji)因(yin)。接(jie)下(xia)來(lai)作者(zhe)(zhe)舉了(le)(le)些例子，例如(ru)在(zai)G等位基(ji)因(yin)劑(ji)量較高(SNP rs4968146)的(de)(de)(de)個體的(de)(de)(de)腎(shen)臟中(zhong)，PT細(xi)(xi)(xi)胞(bao)組(zu)(zu)分(fen)與(yu)ABR表(biao)(biao)達(da)呈負(fu)相(xiang)關，表(biao)(biao)明細(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)(xing)依(yi)賴的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)型(xing)(xing)-基(ji)因(yin)表(biao)(biao)達(da)相(xiang)互作用。明確rs4968146所(suo)在(zai)基(ji)因(yin)組(zu)(zu)區(qu)域在(zai)調節ABR表(biao)(biao)達(da)中(zhong)的(de)(de)(de)作用。作者(zhe)(zhe)在(zai)培養的(de)(de)(de)人(ren)胚胎腎(shen)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(HEK293)中(zhong)進行了(le)(le)基(ji)于CRISPR的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)組(zu)(zu)編輯驗證。在(zai)該區(qu)域缺失后，ABR的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達(da)明顯降(jiang)低。除此之外，作者(zhe)(zhe)還使用了(le)(le)multivariate adaptive shrinkage method (mash)方(fang)法定義了(le)(le)特異細(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)(xing)對應(ying)的(de)(de)(de)eQTL(ci)（具體見下(xia)圖D）。接(jie)下(xia)來(lai)作者(zhe)(zhe)也具有更(geng)多的(de)(de)(de)例子，具體參見圖E。
三、作者接下來結合了snATAC-seq構建了單細胞分辨率的調控圖譜
snATAC-seq分析確定了359，019個可及性染色質峰。并且作者基于不同亞群之間的peaks差異分析，鑒定出了60，661個細胞類型特異性peaks。為了確定這些細胞類型特異性開放染色質區域的轉錄因子，作者使用chromVAR和homer進行了motif 富集。分析發現HNF4A基序在PTs中富集，ESRRB在髓袢中富集，ERG在內皮細胞中富集。通過對8種主要細胞類型的轉錄因子足跡分析顯示，在PT細胞中，HNF4A和HNF4G特異性富集。作者發現，eQTL(ci) 相關的 SNP 通常被預測為會破壞特異細胞類型轉錄因子的結合基序；其中一個例子是rs12481710-SYCP2對，它被預測會破壞PT細胞特異性轉錄因子HNF1A的結合基序。
接下來，作者估計了eQTL(ci)變(bian)異在相關(guan)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)(xing)特(te)異性(xing)(xing)開放(fang)染色質區域(yu)的(de)(de)富集情(qing)況(kuang)。其中發現豐富的(de)(de)腎(shen)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)(xing)(腎(shen)小球內(nei)皮(pi)(pi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)、內(nei)皮(pi)(pi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)、腎(shen)小囊(nang)臟層細(xi)(xi)(xi)胞(bao)、PT細(xi)(xi)(xi)胞(bao)、髓(sui)袢(pan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)和(he)Beta intercalated細(xi)(xi)(xi)胞(bao)) ，eQTL(ci) snp在相應細(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)(xing)的(de)(de)開放(fang)染色質區域(yu)的(de)(de)富集，表明(ming)了細(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)(xing)互作的(de)(de)eqtl與相應的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)(xing)特(te)異性(xing)(xing)調控區域(yu)之間的(de)(de)一致(zhi)性(xing)(xing)。同時(shi)，eQTL(cf)的(de)(de)變(bian)異雖然也(ye)在snATAC-seq中也(ye)存在明(ming)顯(xian)的(de)(de)富集，但是(shi)并沒有(you)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)特(te)異性(xing)(xing)。
同時作者利用貝葉斯共定位檢驗整合6個腎臟相關性狀和eQTL(cf)數據，作者在腎小管中發現了240個共定位蛋白編碼基因，在腎小球室中發現了230個基因。其中FGF5作為SBP（收縮壓）和eGFR（估算腎小球濾過率）的靶基因，在SNP rs3822015處的C等位基因劑量與腎小管中FGF5的高表達有關。SBP和eGFR位點±100kb內的snp的eQTL和GWAS效應大小之間有很強的相關性。作者將與SBP、eGFR相關的SNPs比到PT 特異的開放染色質區域，發現rs3822015具有顯著性，該SNP也破壞了一個假定的HNF4A轉錄因子結合的motif位點。并且作者使用CRISPR進行了驗證敲除該區域會明顯影響FGF5的表達水平。
總的來(lai)說(shuo)，作者(zhe)基(ji)于全面的多(duo)組學數據(ju)集，并(bing)使用正交分析方(fang)法(fa)來(lai)注(zhu)釋與腎(shen)(shen)臟相關的表型。這(zhe)些分析優(you)先選(xuan)擇出了(le)超過182個可(ke)能的腎(shen)(shen)功能致病基(ji)因(yin)(yin)和88個高(gao)血壓致病基(ji)因(yin)(yin)，這(zhe)些可(ke)以作為腎(shen)(shen)臟中這(zhe)些疾病的核心基(ji)因(yin)(yin)。
從文章中可以看出，基于(yu)單細胞結合其他(ta)組(zu)學的(de)分(fen)(fen)析，對于(yu)挖掘相(xiang)關基因，精細篩(shai)選相(xiang)關基因是十(shi)分(fen)(fen)有效的(de)。派森諾(nuo)單細胞空轉生信(xin)部門長期致力于(yu)單細胞多組(zu)學聯合分(fen)(fen)析，總結了多套分(fen)(fen)析與(yu)可視化方案。歡(huan)迎各位老師與(yu)我們聯系(xi)討論。
