2022-07-21
單細(xi)胞(bao)(bao)(bao)轉錄組測(ce)序作(zuo)為(wei)區別于(yu)傳統Bulk-RNA測(ce)序的(de)新興技術，更好的(de)解決了傳統研(yan)究(jiu)中存(cun)在的(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)異質性問題，為(wei)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型鑒(jian)定及新細(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型發現、細(xi)胞(bao)(bao)(bao)發育軌(gui)跡和功(gong)能(neng)分析等提供了良好的(de)解決方案，已廣泛應用于(yu)人類和動(dong)物(wu)研(yan)究(jiu)。目前植物(wu)方面應用范圍也(ye)在逐步擴大，今天本(ben)文(wen)就帶大家一起(qi)看一下2022年2月(yue)7日發表在Developmental Cell上的(de)關于(yu)擬(ni)南芥根系單細(xi)胞(bao)(bao)(bao)圖譜的(de)文(wen)章。
研究背景
在多細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)生物中，轉錄調控網絡精細(xi)(xi)控制著細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)命運以(yi)及器官的(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)育和(he)成熟。想(xiang)對此(ci)進行(xing)全(quan)面的(de)(de)(de)(de)(de)研究，需要(yao)詳細(xi)(xi)的(de)(de)(de)(de)(de)時空基因表達模(mo)式的(de)(de)(de)(de)(de)知(zhi)識。相(xiang)對于(yu)斑馬魚等動物模(mo)型(xing)(xing)，擬南(nan)芥(jie)根系(xi)基于(yu)其簡單的(de)(de)(de)(de)(de)結構和(he)無限生長特性，是(shi)研究發(fa)育軌(gui)跡背(bei)后時空轉錄特征的(de)(de)(de)(de)(de)理(li)想(xiang)模(mo)型(xing)(xing)。然而盡管之前已有(you)部(bu)分(fen)關于(yu)擬南(nan)芥(jie)根系(xi)的(de)(de)(de)(de)(de)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)研究，建立了(le)根系(xi)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)測序的(de)(de)(de)(de)(de)基本原理(li)并成功捕獲到了(le)根系(xi)的(de)(de)(de)(de)(de)所有(you)主要(yao)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類型(xing)(xing)，目前仍沒有(you)超過12500個細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)根系(xi)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)圖(tu)譜(pu)(pu)測序，只(zhi)有(you)一個研究推斷了(le)三種以(yi)上細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類型(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)育進展(zhan)。此(ci)外，每個圖(tu)譜(pu)(pu)都只(zhi)關注了(le)部(bu)分(fen)的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類型(xing)(xing)和(he)發(fa)育狀(zhuang)態。因此(ci)，目前還沒有(you)能夠捕捉(zhuo)到所有(you)主要(yao)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類型(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)育狀(zhuang)態的(de)(de)(de)(de)(de)全(quan)面高(gao)分(fen)辨率的(de)(de)(de)(de)(de)擬南(nan)芥(jie)根系(xi)圖(tu)譜(pu)(pu)。相(xiang)比之下，動物和(he)人類已有(you)數(shu)百萬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)級(ji)別的(de)(de)(de)(de)(de)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)圖(tu)譜(pu)(pu)。
研究思路
研究結果
1、構建(jian)了10萬級細胞的(de)高分(fen)辨率根系單細胞圖譜
在這里，作者對5-7天(tian)的野生(sheng)型和scr、shr突變(bian)體(ti)擬(ni)南芥(jie)主根(gen)根(gen)尖收集了(le)(le)0.5cm的組織進(jin)行10X 3’ 單細(xi)(xi)胞(bao)測序，數(shu)據(ju)統(tong)計分(fen)析(xi)顯示共(gong)捕獲(huo)到了(le)(le)96000多的細(xi)(xi)胞(bao)。為(wei)了(le)(le)增加數(shu)據(ju)深度(du)及評估(gu)不(bu)同實(shi)驗(yan)室間的數(shu)據(ju)變(bian)化，又聯合(he)了(le)(le)3個(ge)已發表(biao)的擬(ni)南芥(jie)根(gen)系(xi)數(shu)據(ju)，建立了(le)(le)一個(ge)器(qi)官尺度(du)的單細(xi)(xi)胞(bao)圖譜(pu)。該圖譜(pu)包(bao)含110427個(ge)細(xi)(xi)胞(bao)，共(gong)檢測到24997個(ge)基因(yin)(yin)，這些細(xi)(xi)胞(bao)的中(zhong)值基因(yin)(yin)為(wei)2768，占擬(ni)南芥(jie)基因(yin)(yin)組中(zhong)編碼基因(yin)(yin)的90%。
進一步通過marker基因(yin)注(zhu)(zhu)(zhu)釋和(he)(he)novoSpaRc等算法分(fen)析(xi)，作(zuo)者成功將這些細(xi)胞注(zhu)(zhu)(zhu)釋為14種(zhong)(zhong)細(xi)胞類型，并將其分(fen)為4個不同的(de)分(fen)支。通過將每(mei)個細(xi)胞轉(zhuan)錄組與人工解剖的(de)分(fen)生組織(zhi)、伸長和(he)(he)成熟區對應的(de)基因(yin)表(biao)(biao)達譜進行比較(jiao)。最后通過已知基因(yin)的(de)基因(yin)表(biao)(biao)達譜分(fen)析(xi)來(lai)評估該發育階段注(zhu)(zhu)(zhu)釋的(de)總體準(zhun)確性。總的(de)來(lai)說，該圖譜可以準(zhun)確描述(shu)單個細(xi)胞類型內部和(he)(he)之間的(de)關系，與前(qian)人研究結果(guo)相似，每(mei)種(zhong)(zhong)組織(zhi)類型都是從(cong)中(zhong)心的(de)年輕細(xi)胞輻射向外圍分(fen)支的(de)老細(xi)胞，表(biao)(biao)明所有主要根細(xi)胞類型的(de)分(fen)化都是持續(xu)的(de)。
2、擬(ni)時序分析(xi)揭(jie)示擬(ni)南(nan)芥根系(xi)細(xi)胞發育軌跡
為(wei)了更詳細的(de)(de)(de)研(yan)究根系細胞系的(de)(de)(de)發育進(jin)程，作者使用CytoTRACE和scVelo進(jin)行了擬時序分析。同時差(cha)異表達(da)分析表明(ming)基因的(de)(de)(de)表達(da)隨著皮層(ceng)和內皮層(ceng)的(de)(de)(de)分化逐漸發生(sheng)變化。類似的(de)(de)(de)，中柱、表皮、側根冠以及(ji)小(xiao)柱細胞之間，基因表達(da)也呈現出(chu)重疊的(de)(de)(de)漸進(jin)的(de)(de)(de)模式。
3、OT分析揭示(shi)擬(ni)南芥根系細胞發育(yu)軌(gui)跡(ji)
進(jin)一步的(de)Stationary OT分析（statanaryot optimal transport，平穩最(zui)有(you)(you)傳輸理論）后，研究人員發現Stationary OT推(tui)斷的(de)發育(yu)軌跡在很大程(cheng)度上獨立于(yu)圖譜(pu)注(zhu)釋(shi)，不需(xu)要(yao)將圖譜(pu)注(zhu)釋(shi)并分割(ge)為(wei)組成譜(pu)系即可反(fan)映現有(you)(you)的(de)每種細胞(bao)和組織類型分化(hua)的(de)生物學知識。
為了(le)(le)鑒(jian)定可能具有預測細胞類型命運規則的(de)表達模式的(de)轉錄因子，作(zuo)(zuo)者(zhe)應用了(le)(le)正則化線性回(hui)歸(gui)算法(fa)（L1-regularized linear regression）驗證了(le)(le)圖譜作(zuo)(zuo)為豐富(fu)的(de)功能特征資源以及Stationary OT方法(fa)在(zai)研究關鍵TFs中的(de)作(zuo)(zuo)用。
4、scRNA-seq揭(jie)示了(le)突變(bian)體的分化(hua)途徑
除了識別新的候選調控因子外，scRNA-seq還可以用來探尋已知調控因子是如何控制組織和器官的發育的。在根的發育過程中，轉錄因子SHR（SHORTROOT）和 SCR（SCARECROW）對根干細胞生態位的維持和組織模式的建立至關重要。作者研究了SHR和SCR功能缺失時，是如何影響根細胞特性和分化的。過往研究中，shr和scr的突變體層組織形態學檢測顯示，突變層在shr中具有皮層樣屬性，在scr中具有皮層和內皮層特征的混合屬性。shr和scr的scRNA-seq數據的分析，發現內皮層的標志性基因在shr和scr中顯著降低。此外，兩個突變體中原木質部細胞豐度降低以及shr中原韌皮部和后韌皮部細胞豐度降低，這與shr和 scr中柱發育缺陷的已有報道一致。作者還發現，木質部和韌皮部中柱鞘細胞豐度也顯著降低；這一結果驗證了shr突變體影響側根發育的假說。
5、scRNA-seq結果顯示scr突變(bian)(bian)層(ceng)(ceng)細胞由皮層(ceng)(ceng)向內皮層(ceng)(ceng)特性(xing)轉變(bian)(bian)
前面講到，scr中的突變體層具有皮層和內皮層特征的混合屬性。那么這種混合特性的出現原因有哪些呢？可能性有多種：1）這些細胞在發育早期分別獲得了皮層或內皮層的特性，并在后期共同組成了混合的突變層；2）每個細胞都具有皮層和內皮層的混合特性；3）這些細胞在發育早期只獲得了其中一個特性，并在后期轉變分化為另一特性。
StationaryOT分析(xi)結(jie)果發(fa)(fa)現，scr突變(bian)(bian)體層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)同(tong)(tong)時具有(you)皮層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)和內(nei)皮層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)的雙(shuang)重特性(xing)。與此(ci)同(tong)(tong)時，scr突變(bian)(bian)體層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)細(xi)胞中年輕(qing)的細(xi)胞更接近皮層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)特性(xing)，而年長(chang)(chang)的細(xi)胞更接近內(nei)皮層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)特性(xing)。相比(bi)之下，在(zai)shr突變(bian)(bian)層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)細(xi)胞的所有(you)發(fa)(fa)育狀(zhuang)態中，皮層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)身份(fen)一(yi)直占主導(dao)地位(wei)。在(zai)WT根系中，內(nei)皮層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)轉錄報告基因(yin)MYB36和皮層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)轉錄報告基因(yin)基因(yin)AT1G09750（CORTEX）在(zai)其各自細(xi)胞類型(xing)的伸(shen)長(chang)(chang)區表(biao)達(da)(da)，MYB36同(tong)(tong)時也在(zai)分生區的內(nei)皮層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)表(biao)達(da)(da)。然而，scRNA-seq數據表(biao)明這些(xie)表(biao)達(da)(da)模(mo)式在(zai)scr突變(bian)(bian)體細(xi)胞層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)中發(fa)(fa)生了改變(bian)(bian)：MYB36在(zai)伸(shen)長(chang)(chang)區較(jiao)老的細(xi)胞中和成熟區表(biao)達(da)(da)，但不在(zai)分生區表(biao)達(da)(da)中；CORTEX只在(zai)早(zao)期延伸(shen)區表(biao)達(da)(da)。
研究結論
綜上所述，本文通過對擬南芥根尖組織的單細胞測序，構建了10萬級細胞的高分辨率根系單細胞基因表達圖譜，并利用CytoTRACE、scVelo和Stationary OT分析揭示了根細胞系的發育軌跡。同時，研究人員比較了WT和根突變體的scRNA-seq分析結果，從單細胞層面上證明了突變層細胞在shr中具有皮層樣屬性，在scr中具有皮層和內皮層特征的混合屬性，并且scr突變體層細胞中年輕的細胞更接近皮層特性，而年長的細胞更接近內皮層特性。該單細胞圖譜作為大數據資源，將有助于研究細胞發育過程中的基因調控網絡，尋找相關轉錄因子以及細胞特性轉化的過程中的轉錄調控機制。
原文鏈接：//doi.org/10.1016/j.devcel.2022.01.008
