2022-07-28
轉眼(yan)到了(le)2022年(nian)的下半年(nian)，各位奮戰在科研實驗，埋首期刊(kan)文(wen)獻中的小(xiao)伙伴可有(you)收(shou)獲(huo)？
最近(jin)一直收到很多老師同學的(de)咨詢，跟(gen)隨單細胞的(de)大潮測了不(bu)少單細胞樣本(ben)，在拿(na)到數據(ju)之(zhi)后不(bu)知道做(zuo)哪些挖掘可以(yi)解決自己想要說明(ming)的(de)問題。
本章專(zhuan)題將結合文(wen)獻(xian)和大(da)家分(fen)享單(dan)細胞中的(de)那些分(fen)析以及結果的(de)闡述。
在進行接下來的(de)(de)介紹(shao)之前，我們假(jia)定(ding)您已(yi)經擁有(you)細胞(bao)分群(qun)已(yi)經細胞(bao)亞群(qun)定(ding)義的(de)(de)結果(guo)。
一：單細胞軌跡研究
在(zai)進行(xing)細胞動態(tai)發育，或者細胞狀態(tai)分化過程(cheng)中，使用軌跡(ji)分析可以(yi)獲得細胞發育的方(fang)向以(yi)及狀態(tai)。同時也有(you)助于獲得處于中間(jian)態(tai)的細胞類型。
迄今為止，單細(xi)胞軌跡研究方法(fa)的研究論文已有(you)很多。常見的有(you)monocle擬時(shi)序分(fen)析(xi)、RNA velocity細(xi)胞速率、Palantir擬時(shi)序分(fen)析(xi)、CytoTRACE細(xi)胞分(fen)化潛能(neng)、PAGA軌跡推斷等。
接下來我們給大家(jia)分享一下這些方法(fa)的(de)應(ying)用實例：
2017年發表于(yu)(yu)《Cell》上的《Landscape of infiltrating T cells in liver cancer revealed by single-cell sequencing》使用monocle2對(dui)CD8+T細胞(bao)(bao)和(he)CD4+T輔助細胞(bao)(bao)進(jin)行了擬時序分析，結合TCR共同驗證解釋了CD8+T 從C1_CD8-LEF1細胞(bao)(bao)(na?ve CD8+T細胞(bao)(bao))，其次是C2_CD8-CX3CR1(效(xiao)應記憶CD8+T細胞(bao)(bao))到(dao)C5_CD8-GZMK，最終(zhong)是到(dao)C4_CD8-LAYN細胞(bao)(bao)（耗竭T細胞(bao)(bao)）的轉(zhuan)變，基(ji)于(yu)(yu)這種軌跡分析，作者發現C5_CD8-GZMK似乎是效(xiao)應T細胞(bao)(bao)和(he)耗竭T細胞(bao)(bao)之間的中間狀態(tai)。
接(jie)下來作者分析了(le)CD4+T輔(fu)助(zhu)細胞(bao)(bao)(bao)來確定(ding)分化(hua)軌跡(ji)。根據擬時(shi)序的結果，C6_CD4-CCR7幼稚T細胞(bao)(bao)(bao)和(he)C9_CD4-GZMA T輔(fu)助(zhu)細胞(bao)(bao)(bao)主要聚集在(zai)(zai)偽(wei)時(shi)序的主干(gan)上。C10_CD4-CXCL13(耗竭CD4+T細胞(bao)(bao)(bao))和(he)C11_CD4-GNLY(細胞(bao)(bao)(bao)毒性CD4+T細胞(bao)(bao)(bao))細胞(bao)(bao)(bao)在(zai)(zai)偽(wei)時(shi)序軌跡(ji)圖中位于不同的方向，表(biao)明這些(xie)細胞(bao)(bao)(bao)在(zai)(zai)功能上存在(zai)(zai)差異(yi)。
2020年發表于《Cell》上的《Molecular Pathways of Colon Inflammation Induced by Cancer Immunotherapy》使用細(xi)胞(bao)速率分(fen)析解析了(le)在(zai)揭示了(le)從Trm向細(xi)胞(bao)毒(du)性效應細(xi)胞(bao)的潛在(zai)分(fen)化軌跡(ji)，這也(ye)就解釋了(le)在(zai)+CPI colitis 樣(yang)本(ben)中(zhong)，部分(fen)增殖T細(xi)胞(bao)與毒(du)性T細(xi)胞(bao)的產生是(shi)由(you)Trm細(xi)胞(bao)的直接(jie)分(fen)化導致(zhi)，解釋說明了(le)免疫治療早期就能在(zai)病人腸道中(zhong)觀察到炎(yan)性癥狀的原因。
二：基因集分析
基(ji)因(yin)集(ji)分析在腫瘤樣本(ben)的(de)分析中也是十分常見的(de)的(de)手段，基(ji)于感(gan)興趣的(de)基(ji)因(yin)集(ji)使用不同的(de)打分方法來(lai)對細胞進(jin)行評分，可以(yi)比較直觀的(de)定位到自己(ji)關注的(de)通路是否存在差異。
如(ru)今的基因集分析的方(fang)法也是多種(zhong)多樣，GSVA、AUCELL、AddModuleScore、GSEA等(deng)較為常(chang)見，接(jie)下來我們來分享(xiang)一些這(zhe)些方(fang)法的應(ying)用:
2020年發(fa)表(biao)在《Nature Communications》上的《Single-cell RNA landscape of intratumoral heterogeneity and immunosuppressive microenvironment in advanced osteosarcoma》在(zai)文(wen)章中(zhong)多次用到了GSEA對細(xi)胞(bao)進(jin)行(xing)通路(lu)評(ping)分。其中(zhong)，作(zuo)者對骨肉(rou)瘤樣本(ben)中(zhong)捕獲(huo)的10個髓(sui)系亞群(qun)進(jin)行(xing)了GSEA細(xi)胞(bao)通路(lu)評(ping)分，GSEA分析表明，M1-TAMs在(zai)IFN-α，IFN-γIL2/STAT5IL6/JAK/STAT3和(he)炎癥反應(ying)等通路(lu)上顯示較高(gao)的活性，表明這(zhe)些巨(ju)噬細(xi)胞(bao)可能來(lai)自(zi)于IFN-α和(he)IFN-γ刺激的促炎微(wei)環境(jing)下(xia)，進(jin)一(yi)步發現，M1-TAMs顯示出TGF-β和(he)刺猬(wei)信號通路(lu)的活性升高(gao)，從而(er)誘導M2極化。接(jie)下(xia)來(lai)作(zuo)者使用GSVA發現有部分M2-TAMs 高(gao)表達M1-TAMs的marker基因(yin)，證實了M1-TAMs和(he)M2-TAMs在(zai)骨肉(rou)瘤TME中(zhong)的動態(tai)轉化。
2018年發表(biao)于《Nature Medicine》上的(de)《Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment》首先使用GSVA解析(xi)了內皮(pi)細(xi)(xi)胞(bao)、濾(lv)泡B細(xi)(xi)胞(bao)、巨噬細(xi)(xi)胞(bao)等hallmark通路評分，接下(xia)來，使用差異(yi)分析(xi)分別比(bi)較這些細(xi)(xi)胞(bao)類(lei)型下(xia)腫瘤(liu)細(xi)(xi)胞(bao)和(he)非惡性細(xi)(xi)胞(bao)的差異(yi)。
發現(xian)了對(dui)比腫(zhong)瘤和(he)正常內皮(pi)細(xi)(xi)胞，Myc靶點(dian)是(shi)(shi)腫(zhong)瘤內皮(pi)細(xi)(xi)胞中最(zui)富集的(de)(de)特征。在(zai)濾泡B細(xi)(xi)胞中，腫(zhong)瘤相(xiang)(xiang)關的(de)(de)濾泡B細(xi)(xi)胞相(xiang)(xiang)較(jiao)于(yu)非惡性相(xiang)(xiang)關的(de)(de)濾泡B細(xi)(xi)胞，在(zai)氧化磷酸化、細(xi)(xi)胞增殖(zhi)和(he)生物量產生活性下降（與Myc、mTOR和(he)蛋白(bai)質分泌相(xiang)(xiang)關的(de)(de)途徑)。與之對(dui)應的(de)(de)是(shi)(shi)，腫(zhong)瘤相(xiang)(xiang)關肺泡B細(xi)(xi)胞的(de)(de)轉錄數比非惡性相(xiang)(xiang)關肺泡B細(xi)(xi)胞低37.9%。這也說明了在(zai)腫(zhong)瘤中濾泡B細(xi)(xi)胞可能已經耗竭。
三：細胞通訊分析
細胞(bao)通訊作(zuo)為(wei)研(yan)究細胞(bao)間互作(zuo)的(de)(de)利器(qi)一直在(zai)很(hen)多(duo)高(gao)分文章中出(chu)現(xian)，細胞(bao)通訊的(de)(de)研(yan)究也有(you)很(hen)多(duo)，常見的(de)(de)有(you)CellPhoneDB、CellChat、NicheNet、NATMI、Celltalker等。這些(xie)方法(fa)各有(you)特(te)點，使用(yong)的(de)(de)配受體數據庫也或有(you)差異。基于(yu)研(yan)究物(wu)種類型、組織類型的(de)(de)差異需要合適選用(yong)。
接下(xia)來(lai)我(wo)們來(lai)看看細胞通訊分析的實(shi)例：
在2021年(nian)發表(biao)于《Nature Communications》上(shang)的《Tumour heterogeneity and intercellular networks of asopharyngeal carcinoma at single cell resolution》這篇單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)鼻(bi)咽癌研究(jiu)中(zhong)(zhong)，作(zuo)者使(shi)用(yong)(yong)CellPhoneDB對CD8+T、CD4+T、NK、B、髓系(xi)和(he)(he)惡(e)性細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)進行了分析。其(qi)中(zhong)(zhong)，預測(ce)DC_C3_LAMP3細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)通過CCL17-CCR4和(he)(he)CCL22-CCR4配(pei)受體關系(xi)與(yu)外周血中(zhong)(zhong)的Treg_C1_SELL細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)相互作(zuo)用(yong)(yong)，這些CCL14將Treg細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)招募到腫(zhong)瘤(liu)(liu)組織中(zhong)(zhong)。Treg_C4_TNFRSF4細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)均有CTLA4、ENTPD1和(he)(he)CSF1的高(gao)表(biao)達，在DC_C3_LAMP3細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)上(shang)顯示(shi)出配(pei)體-受體與(yu)CD80/CD86、ADORA2A和(he)(he)SIRPA結合(he)，提示(shi)Treg_C4_TNFRSF4和(he)(he)DC_C3_LAMP3細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)之間(jian)可(ke)能存在相互作(zuo)用(yong)(yong)。DC_C3_LAMP3細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)也被預測(ce)到通過CD200-CD200R信號通路與(yu)CD8_C11_PDCD1細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)相互作(zuo)用(yong)(yong)，這是(shi)一種參與(yu)抑(yi)制抗(kang)腫(zhong)瘤(liu)(liu)反應的非(fei)經典免(mian)(mian)疫抑(yi)制途(tu)徑，此(ci)外還(huan)觀察到Treg_C4_TNFRSF4和(he)(he)CD8_C11_PDCD1細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)之間(jian)潛在的配(pei)體-受體相互作(zuo)用(yong)(yong)，包括(kuo)趨化因(yin)子(CCL4-CCR8)、粘附連(lian)接(ITGAL-ICAM1和(he)(he)SELPLG-SELL)和(he)(he)免(mian)(mian)疫調(diao)節(HAVCR2-LGALS9)，這些在腫(zhong)瘤(liu)(liu)TME中(zhong)(zhong)已經經過驗證報道(dao)，促(cu)進Treg細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)的免(mian)(mian)疫抑(yi)制活(huo)性和(he)(he)CD8+T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)衰竭。
今天的方(fang)法介紹就到這里，大家可以(yi)關注我們，我們會持續(xu)更新(xin)這個(ge)專(zhuan)題系列(lie)，為大家更新(xin)更多的研究方(fang)法與(yu)思路。
