microSPLiT基于SPLiT-seq，SPLiT-seq是(shi)一種真核生物(wu)的(de)(de)scRNA-seq方法，在(zai)SPLiT-seq中，細胞被分布到一個(ge)96孔板中，并使用(yong)(yong)特異(yi)性的(de)(de)條形碼引物(wu)，利用(yong)(yong)細胞內逆轉錄（RT）反應產生cDNA。因為(wei)每個(ge)孔都(dou)可以(yi)(yi)包含不同的(de)(de)生物(wu)樣品，所(suo)以(yi)(yi)在(zai)一個(ge)實驗(yan)中可以(yi)(yi)對多達96個(ge)樣本(ben)實現多路復(fu)用(yong)(yong)。具體的(de)(de)示意圖如(ru)下：

SPLiT-seq示意圖【3】

因為SPLiT-seq不需(xu)要細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)隔離，所以(yi)它與廣泛的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)形狀和(he)大小兼容，這也(ye)避免了小尺(chi)寸在微流控單(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中分離不理(li)想的(de)(de)情況。作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)首先直(zhi)接(jie)將SPLiT-seq應用(yong)(yong)于微生物(wu)中，發(fa)現(xian)UMI數(shu)和(he)mRNA的(de)(de)捕獲都十分不理(li)想。接(jie)下來，作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)優化(hua)(hua)了細(xi)(xi)(xi)菌的(de)(de)樣品(pin)處(chu)理(li)步(bu)(bu)驟。考慮到(dao)SPLiT-seq的(de)(de)多路復用(yong)(yong)能力，作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)測試了一(yi)系列(lie)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)壁去除和(he)膜通透(tou)的(de)(de)方法。作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)發(fa)現(xian)使(shi)用(yong)(yong)溫和(he)去垢(gou)劑(ji)Tween-20和(he)溶菌酶組合的(de)(de)方案對革蘭氏(shi)陽性(xing)枯草芽孢(bao)桿菌和(he)革蘭氏(shi)陰性(xing)大腸(chang)桿菌的(de)(de)捕獲效率(lv)最高(gao)。為了實現(xian)mRNA的(de)(de)富(fu)集(ji)，作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)用(yong)(yong)E. coli Poly(A) Polymerase 大腸(chang)桿菌poly(A)聚合酶 (PAP) 進行多聚腺苷化(hua)(hua)；以(yi)及加入(ru)5'-磷酸核酸外(wai)切(qie)酶；用(yong)(yong)核糖體rna特異(yi)性(xing)探針進行RT，然后使(shi)用(yong)(yong)RNase H進行降解。作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)發(fa)現(xian)，用(yong)(yong)PAP處(chu)理(li)固定細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)和(he)通透(tou)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)后，mRNA reads的(de)(de)富(fu)集(ji)量(liang)最高(gao)(約為2.5倍，約占總(zong)RNA的(de)(de)7%)。同時作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)還優化(hua)(hua)了固定方案以(yi)及下游的(de)(de)酶促反應。同時作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)還提醒到(dao)，使(shi)用(yong)(yong)RT會導致細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)聚集(ji)，并且在這一(yi)步(bu)(bu)之(zhi)后的(de)(de)輕度超聲處(chu)理(li)對于可靠地獲得單(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)懸液是(shi)必要的(de)(de)。

microSPLiT步驟示意圖

為了測試microSPLiT性能，作者將大腸桿菌MW1255和枯草芽孢桿菌PY79細胞培養到600nm (OD₆₀₀) = 0.5 (OD0.5)，并將每個培養物的一半進行短暫的47°C熱休克。

作者對這2682個(ge)混(hun)合(he)細菌(jun)進行了(le)單(dan)細胞測(ce)序，并(bing)且(qie)將其比(bi)對至大腸桿(gan)(gan)菌(jun)和枯(ku)草(cao)芽(ya)孢(bao)桿(gan)(gan)菌(jun)的(de)(de)(de)合(he)并(bing)基因組上，結(jie)果發現轉錄本（UMI）的(de)(de)(de)分配比(bi)較明確(que)，細胞混(hun)合(he)的(de)(de)(de)情(qing)況比(bi)較少，其中(zhong)大腸桿(gan)(gan)菌(jun)每個(ge)細胞的(de)(de)(de)中(zhong)位(wei)數為(wei)235個(ge)mRNA轉錄本，枯(ku)草(cao)芽(ya)孢(bao)桿(gan)(gan)菌(jun)為(wei)397個(ge)，約占估計總mRNA的(de)(de)(de)5-10%，需要(yao)說明的(de)(de)(de)是在(zai)真核生物中(zhong)這種(zhong)捕獲水平也是很不錯的(de)(de)(de)了(le)。并(bing)且(qie)兩種(zhong)細菌(jun)均捕獲到了(le)rRNA, 中(zhong)位(wei)數分別(bie)為(wei)3753和6033條reads。去(qu)除多重比(bi)對的(de)(de)(de)reads后(hou)，枯(ku)草(cao)芽(ya)孢(bao)桿(gan)(gan)菌(jun)的(de)(de)(de)mRNA reads比(bi)例增加到90.5%，大腸桿(gan)(gan)菌(jun)為(wei)28.2%。，而每個(ge)細胞的(de)(de)(de)mRNA UMI計數沒(mei)有受到特別(bie)大的(de)(de)(de)影響。

接下來，作者試了microSPLiT是否可以檢測到對熱休克(ke)的(de)轉錄反(fan)應(ying)。無監(jian)督(du)聚(ju)類(lei)識別出5個不同的(de)亞群(qun)，使用t-SNE進行降維可視(shi)化(hua)，可以看出根(gen)據處(chu)理(li)與兩(liang)個細菌(jun)類(lei)別亞群(qun)呈(cheng)現了清晰的(de)分布，并且經典熱休克(ke)基因在大腸桿菌(jun)和枯草芽(ya)孢桿菌(jun)熱處(chu)理(li)簇中富(fu)集。

比較有趣的(de)(de)(de)是亞(ya)群5，作者發現(xian)這個亞(ya)群來自(zi)對(dui)照(zhao)和(he)熱處(chu)理的(de)(de)(de)大(da)腸(chang)桿菌(jun)(jun)細(xi)胞(bao)，這些細(xi)胞(bao)表達了DEAD-box解(jie)旋酶家族誘導以(yi)及冷(leng)休克基因cspA對(dui)cspG的(de)(de)(de)特征，與對(dui)冷(leng)的(de)(de)(de)轉錄(lu)反(fan)應(ying)一致。作者解(jie)釋其為(wei)大(da)腸(chang)桿菌(jun)(jun)亞(ya)群可能(neng)對(dui)甲醛固(gu)定前第一步的(de)(de)(de)短暫(zan)冷(leng)離心步驟表現(xian)出非常快速(su)的(de)(de)(de)反(fan)應(ying)，因此(ci)可能(neng)是工作流程的(de)(de)(de)人為(wei)因素。

相對于(yu)模式(shi)物種等真核(he)生(sheng)物的(de)(de)(de)單細胞，微生(sheng)物的(de)(de)(de)單細胞分(fen)(fen)析(xi)手段雖然都(dou)是(shi)類(lei)似的(de)(de)(de)，但是(shi)其中(zhong)(zhong)可以(yi)獲(huo)取的(de)(de)(de)信息確實(shi)(shi)相當新穎的(de)(de)(de)。作者接(jie)下來使(shi)用microSPLiT應用于(yu)在富培養基(LB)中(zhong)(zhong)枯(ku)草(cao)芽孢桿菌(jun)不同生(sheng)長節(jie)點(dian)(dian)的(de)(de)(de)轉錄(lu)狀態。作者對實(shi)(shi)驗室菌(jun)株PY79的(de)(de)(de)生(sheng)長曲線采樣10個(ge)(ge)OD點(dian)(dian)，OD值(zhi)從0.5（早期指(zhi)數(shu)階段）到OD值(zhi)為6.0（早期穩定階段），并且對四個(ge)(ge)節(jie)點(dian)(dian)取了(le)(le)重復(fu)。并且使(shi)用第一(yi)個(ge)(ge)條形碼(ma)用于(yu)記錄(lu)樣本身份(fen)(即OD)，經此產生(sheng)了(le)(le)25,214個(ge)(ge)細胞，亞群(qun)聚類(lei)獲(huo)得了(le)(le)14個(ge)(ge)細胞群(qun)，其中(zhong)(zhong)多數(shu)可以(yi)和(he)OD一(yi)一(yi)對應。最顯著的(de)(de)(de)例外是(shi)兩個(ge)(ge)較小的(de)(de)(de)細胞群(qun)，包(bao)(bao)含(han)細胞從多個(ge)(ge)OD，亞群(qun)9，包(bao)(bao)含(han)OD2、OD3.2，差異表(biao)達(da)肌醇代謝途徑(jing)基因(yin)(yin)(yin)(yin)，亞群(qun)13，只包(bao)(bao)含(han)36個(ge)(ge)細胞，來自于(yu)五(wu)個(ge)(ge)不同的(de)(de)(de)OD點(dian)(dian)，差異表(biao)達(da)的(de)(de)(de)基因(yin)(yin)(yin)(yin)與缺陷PBSX噬菌(jun)體有關。接(jie)下來作者主要分(fen)(fen)析(xi)了(le)(le)sigma因(yin)(yin)(yin)(yin)子的(de)(de)(de)表(biao)達(da)變化，以(yi)及(ji)各自調控(kong)(kong)因(yin)(yin)(yin)(yin)子的(de)(de)(de)基因(yin)(yin)(yin)(yin)表(biao)達(da)中(zhong)(zhong)推斷(duan)出所選擇的(de)(de)(de)轉錄(lu)調控(kong)(kong)因(yin)(yin)(yin)(yin)子的(de)(de)(de)活(huo)性譜(pu)，這(zhe)部分(fen)(fen)的(de)(de)(de)分(fen)(fen)析(xi)主要可以(yi)證實(shi)(shi)microSPLiT捕獲(huo)了(le)(le)已知(zhi)的(de)(de)(de)調控(kong)(kong)程序，并揭(jie)示了(le)(le)廣泛的(de)(de)(de)細胞通路的(de)(de)(de)異質性。

MicroSPLiT檢測枯草芽孢桿菌生長過程中的整體轉錄狀態

由于作者在(zai)(zai)轉(zhuan)錄調(diao)控因(yin)(yin)子分析中觀察到(dao)的(de)(de)碳(tan)利用調(diao)控的(de)(de)變化(hua)，作者從而對每個簇中富(fu)集的(de)(de)碳(tan)代(dai)謝基因(yin)(yin)進行了更全面的(de)(de)檢(jian)查。當葡萄糖(tang)和(he)其(qi)(qi)他首選糖(tang)存在(zai)(zai)時(shi)，它們(men)在(zai)(zai)糖(tang)酵(jiao)解過(guo)程中轉(zhuan)化(hua)為(wei)丙酮酸，這(zhe)是這(zhe)些糖(tang)豐(feng)富(fu)時(shi)的(de)(de)主要(yao)代(dai)謝途徑。在(zai)(zai)這(zhe)些促進快速生(sheng)長的(de)(de)條件(jian)下，丙酮酸通過(guo)發酵(jiao)轉(zhuan)化(hua)為(wei)乳酸、醋酸、乙酸、乙酰酯和(he)其(qi)(qi)他副產品。在(zai)(zai)首選糖(tang)耗盡后，細胞將發酵(jiao)副產物重新在(zai)(zai)三羧酸(TCA)循環中代(dai)謝，生(sheng)成額外(wai)的(de)(de)三磷酸腺苷(gan)(ATP)和(he)二氧化(hua)碳(tan)。

作者觀察到，在對應早期OD的亞群種（亞群0到4），高表達的基因參與糖酵解如葡萄糖滲透酶(ptsG)和基因參與快速生長和發酵，如乳酸脫氫酶(ldh)、丙酮酸脫氫酶(pdhA)和醋酸激酶(ackA)。在OD值為1.7時，細胞似乎經歷了從糖酵解到糖異生的劇烈轉變，在亞群7和亞群8中激活了來自糖異生途徑的多個基因。此外作者還發現了一種不同的丙酮酸生產和利用模式，以及另一種發酵產物乙酰蛋白的分解代謝，以及額外進入三羧酸循環的營養通量。

基于這些(xie)基因的(de)(de)(de)表達模式。作(zuo)者還發(fa)現了不同碳(tan)源的(de)(de)(de)吸收和利用(yong)途(tu)徑的(de)(de)(de)表達，當首選的(de)(de)(de)碳(tan)來源被(bei)耗盡時(shi)，替(ti)代碳(tan)利用(yong)途(tu)徑的(de)(de)(de)主(zhu)要抑(yi)制因子CcpA變(bian)得不活躍(yue)，允許(xu)細胞(bao)分解多種碳(tan)水化(hua)合(he)物。作(zuo)者推斷，這些(xie)通路的(de)(de)(de)激活和抑(yi)制發(fa)生在(zai)每個(ge)OD樣本中(zhong)(zhong)細胞(bao)的(de)(de)(de)不同比例中(zhong)(zhong)，并(bing)且似乎遵循一個(ge)時(shi)間順(shun)序。

肌醇是土壤中豐富的資源，枯草芽孢桿菌能夠以肌醇作為其唯一的碳源來生存。雖然LB介質通常不需要含有肌醇，但是作者在兩個獨立LB生長實驗中，在亞群9（OD3-3.2）中觀察到有一小部分細胞異質肌醇利用途徑的激活。作者推測這些結果來自于LB培養基中存在的微量肌醇，可能來自酵母提取物，因為酵母能夠產生肌醇作為必要的膜成分磷脂酰肌醇的前體。有三個操縱子參與肌醇的利用：iolT（主要轉運體），iolRS (第一個基因是抑制因子，第二個基因是脫氫酶-like)以及iolAJ（代謝酶），iolRS和iolAJ通常是由sigma A進行轉錄。在葡萄糖存在時，CcpA抑制iolAJ操縱子。值得注意的是，作者觀察到通路抑制基因iolR基因在簇9的內外表達更廣泛。為了驗證發現，作者構建了肌醇代謝途徑中所有三個操縱子的熒光報告基因[轉錄報告基因P_iolA-YFP和P_iolR-CFP和蛋白質基因融合IolT-mScarlet-I]，作者觀察到在肌醇作為唯一碳源的存在下，所有三個操縱子的廣泛表達。在LB中生長的細胞在OD2時有22.7%表達P_iolA-YFP，在 OD4時44%的細胞有P_iolA-YFP的異質表達。而在LB中生長到OD0.7的細胞，P_iolA-YFP有更強的表達。雖然microSPLiT數據顯示，細胞表達肌醇代謝基因（屬于亞群9）從OD3.2的5%到OD5.3的0.3%，YFP在OD4的表達還呈現積累狀態，這與熒光蛋白成熟的延遲和熒光蛋白的高穩定性相一致，熒光蛋白主要在細胞分裂過程中通過稀釋從細胞中清除。總結而言，通過轉錄組學和熒光報告數據表明，在LB中生長的對數生長期和穩定期初期的細胞亞群中，肌醇代謝途徑中的基因轉錄以異質方式被激活。激活分子的來源以及這種行為背后潛在的基因調控網絡仍有待確定。

枯草芽孢桿菌生長過程中中心碳代謝的變化和替代碳源的利用

細菌普遍產生肽和小分子抗菌素，旨在針對密切和遠緣的生物體。作者觀察了至少三種廣譜抗菌素：枯草桿菌素、桿菌素和鉑素在ODs的不同細胞中的表達。在最后三個ODs中，作者還發現了孢子殺滅因子基因(skf)和孢子延遲蛋白基因(sdp)的增加。接下來作者觀察到部分細胞表達運動性基因(有hag編碼的操縱子和鞭毛蛋白)，在OD6.0時顯著下降，同時表面actin蛋白(srfAA~srfAD)在OD值為6.0時幾乎百分百表達。作者還發發現，參與未折疊蛋白反應的基因：如clpp相關蛋白酶(clpP、clpC、clpX和clpE)、McsA和McsB激酶(mcsA和mcsB)以及伴侶蛋白(groEL和groES)在OD1.7達到峰值，與細胞從糖酵解轉換為糖異生時相同，這些基因的表達是由正常指數生長過程中調節sigma B活性的瞬時增加而導致的。除此之外，作者還分析了與金屬相關的基因的表達，如鐵載體桿菌動蛋白(fhbA)與相關轉運體(mntA)和錳轉運體(mntA到mntD)。

內在的應激反應和發育性基因的表達

亞群13 (36個細胞，總細胞的0.142%，代表ODs在0.5-2.8)包含一個罕見的表達PBSX原噬菌體基因的細胞亞群。PBSX元件是一種有缺陷的噬菌體，是非傳染性的，在誘導后導致噬菌體樣顆粒的釋放，其中包含13kb的隨機片段染色體DNA。原噬菌體基因的表達是由DNA損傷誘導的，在指數生長過程中在一小部分細胞中被激活， 13亞群中差異表達的大多數基因代表已知的PBSX噬菌體基因，其中包括PBSX噬菌體溶解(xlyA和xlyB、xhlA和xhlB)、噬菌體釋放(xepA)和噬菌體復制(xtmA和xtmB)，以及許多功能未知的PBSX相關基因。作者不僅鑒定了一個罕見的處于原噬菌體誘導狀態的細胞亞群，而且還捕獲了主要的原噬菌體相關操縱子的表達。同時還鑒定了11個在PBSX原噬菌體簇中表達的已知或假定功能的宿主基因。其中5個基因先前已被證明僅在含有枯草芽孢桿菌的PBSX菌株中被誘導。其他的基因中還包含 化學受體蛋白（mcpC），atp結合盒轉運體(liaL)，細胞壁結合蛋白(ykuG)，銨轉運體(amtB)，蔗糖6磷酸水解酶(sacA)和同源重組調節蛋白(recX)，這些以前沒有被認為與噬菌體誘導有關。

在脅迫或營養限制下，一小部分（2-5%）枯草芽孢桿菌細胞經歷隨機短暫分化為自然能力狀態，其特征是能夠攝取細胞外DNA并將其整合到染色體。主調控因子ComK通過正反饋調節被激活，并且誘導一系列基因的表達，并參與多種細胞過程。作者分別對最后兩個OD點(OD5.3和OD6.0)進行了亞聚類。在UMAP圖上，可以看到一個小的亞群(62個細胞，占OD5.3和OD6的細胞的4.6%)表達了一個獨特的感受態或k態的轉錄特征，與之前的研究類似，最豐富表達的基因是comGA，其次是琥珀酰輔酶A結合酶（sucCD），同時作者還觀察到編碼DNA攝取機制的基因的富集：comF和comE操縱子；反應調節器(rapH)，它抑制活性細胞的產孢發育，以及處理單鏈DNA加工所需的基因，如recA，以及單鏈DNA結合蛋白SsbA和SsbB。總的來說，實驗捕獲到了與之前報道能力相關的基因，并且還發現了四個新的未報道與該狀態相關的基因。

細胞應激誘導的罕見發育狀態