隨著單細(xi)胞(bao)測序技術(shu)的(de)(de)迅(xun)速發展，其在臨床研究、基(ji)礎(chu)(chu)科(ke)研等領(ling)域(yu)的(de)(de)應(ying)用(yong)成(cheng)果已經得到了(le)認可，在探究細(xi)胞(bao)異質性問題中發揮了(le)不可替代(dai)的(de)(de)作用(yong)。為了(le)將單細(xi)胞(bao)測序技術(shu)更廣泛地應(ying)用(yong)到各(ge)領(ling)域(yu)研究中去(qu)，人們逐漸將目光鎖定到了(le)微生(sheng)物領(ling)域(yu)，以微流控為基(ji)礎(chu)(chu)的(de)(de)微生(sheng)物高通量單細(xi)胞(bao)基(ji)因組學(xue)技術(shu)——Microbe-seq應(ying)運而生(sheng)，正式開啟微生(sheng)物單細(xi)胞(bao)應(ying)用(yong)新時代(dai)。

2022年6月3日哈佛大學(xue)和麻省理工學(xue)院的研究(jiu)團(tuan)隊(dui)在Science上聯合發表了(le)題目為High-throughput, single-microbe genomics with strain resolution, applied to a human gut microbiome的研究(jiu)長文，文中(zhong)介紹了(le)該團(tuan)隊(dui)在微生(sheng)物(wu)群落研究(jiu)方(fang)法學(xue)上的重(zhong)大突破性技(ji)術：Microbe-seq。

運用(yong)這項(xiang)技(ji)術(shu)，作者團(tuan)隊從來自人類(lei)腸道的(de)復雜微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)群落中(zhong)分離出(chu)單個(ge)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)的(de)基因(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)：用(yong)微(wei)(wei)流控技(ji)術(shu)將單個(ge)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)包(bao)(bao)裹在(zai)液滴中(zhong)裂解細胞釋放DNA，用(yong)液滴中(zhong)含有的(de)特異性barcode進行標(biao)記擴(kuo)增、測序，共得到了(le)20,000多(duo)個(ge)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)單擴(kuo)增基因(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)，組(zu)(zu)(zu)(zu)裝成了(le)近100個(ge)細菌(jun)(jun)(jun)(jun)物(wu)(wu)種的(de)基因(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)，其中(zhong)包(bao)(bao)括幾種具有多(duo)個(ge)亞種菌(jun)(jun)(jun)(jun)株(zhu)的(de)細菌(jun)(jun)(jun)(jun)，利用(yong)這些基因(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)來探(tan)索微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)之(zhi)間的(de)相互(hu)作用(yong)，重建了(le)水平(ping)基因(yin)轉移(HGT)網絡并發現(xian)了(le)92個(ge)物(wu)(wu)種對之(zhi)間的(de)HGT，并發現(xian)了(le)噬菌(jun)(jun)(jun)(jun)體與一株(zhu)普(pu)通擬桿菌(jun)(jun)(jun)(jun)的(de)體內宿主(zhu)-噬菌(jun)(jun)(jun)(jun)體關聯關系。

目前在(zai)人類腸(chang)道中(zhong)已經探察到近千(qian)種腸(chang)道菌(jun)(jun)群，然而每個(ge)個(ge)體(ti)的(de)(de)腸(chang)道菌(jun)(jun)群組(zu)成(cheng)都是特異的(de)(de)，即(ji)使是同(tong)(tong)一菌(jun)(jun)種的(de)(de)不(bu)(bu)同(tong)(tong)菌(jun)(jun)株間也會(hui)因基(ji)因組(zu)的(de)(de)變異表(biao)現出不(bu)(bu)同(tong)(tong)性(xing)狀，這些差異性(xing)狀導(dao)致它們在(zai)生(sheng)化反應、代謝產物(wu)的(de)(de)產量、耐藥性(xing)以及與宿主免疫系統的(de)(de)相互作用等(deng)方面有著截然不(bu)(bu)同(tong)(tong)的(de)(de)表(biao)現，會(hui)直接(jie)影響個(ge)體(ti)健(jian)康情況(kuang)。不(bu)(bu)僅如此，菌(jun)(jun)株之(zhi)間的(de)(de)相互作用也同(tong)(tong)樣(yang)會(hui)影響到腸(chang)道微生(sheng)物(wu)群落(luo)中(zhong)的(de)(de)微生(sheng)物(wu)行為，比如噬菌(jun)(jun)體(ti)調節細(xi)菌(jun)(jun)組(zu)成(cheng)，微生(sheng)物(wu)細(xi)胞之(zhi)間遺傳(chuan)物(wu)質(zhi)的(de)(de)轉移等(deng)等(deng)。

受現有技術水平限制，現階(jie)段人們僅能(neng)夠(gou)在物(wu)種水平上分析微生物(wu)菌群組成，并不能(neng)全面解析特定微生物(wu)的基因(yin)和(he)功能(neng)途徑，因(yin)此，急(ji)切地(di)需要(yao)一種菌株水平的解析方法來填補技術空白，為人們理解腸道微生物(wu)行為及其對健康(kang)的影響(xiang)提供幫(bang)助(zhu)。

一直以來，學者(zhe)們一直在嘗試(shi)使用各種方法來探索菌(jun)株水(shui)平的基因組問題，但得(de)到的結果總是(shi)不理想(xiang)：

1、鳥(niao)槍法宏基因組(zu)學盡管(guan)已經有部分技(ji)術進步(如(ru)長讀長測(ce)序(xu)、read-cloud測(ce)序(xu)和Hi-C)開始提供(gong)一(yi)些物(wu)種(zhong)的菌株(zhu)水(shui)平信(xin)息，但還是不能有效地區分單個(ge)樣(yang)本(ben)中(zhong)多個(ge)分類群共有的DNA序(xu)列，例如(ru)當一(yi)個(ge)物(wu)種(zhong)有多個(ge)菌株(zhu)或多個(ge)分類群的基因組(zu)中(zhong)出(chu)現(xian)同源序(xu)列時。

2、傳統的培(pei)養(yang)方法只能培(pei)養(yang)出少(shao)數易(yi)于生(sheng)長的微生(sheng)物菌株，且成(cheng)本(ben)偏(pian)高(gao)，耗時長，不能還原樣(yang)本(ben)微生(sheng)物菌群的全貌。

3、基于微孔板的(de)單細胞測序雖然(ran)可以測出菌(jun)株水(shui)平的(de)基因(yin)組，并(bing)已被用于探測噬菌(jun)體和(he)細菌(jun)之(zhi)間(jian)的(de)關聯，但由于技術及成本限制，只(zhi)能依賴于在滴度板上的(de)孔中分離和(he)裂解單個或大約(yue)十幾個微生(sheng)物，再(zai)擴(kuo)增其全基因(yin)組進(jin)行測序，涉及細胞數量(liang)過(guo)少。

對于(yu)所有這些現(xian)用方法，技術手段嚴重限制了(le)生成源自同一群(qun)落的菌株分(fen)辨基因組(zu)的數(shu)量，從(cong)而限制了(le)對人體腸道微生物組(zu)的基因組(zu)結構(gou)和行(xing)為的了(le)解。

微(wei)生物高通量(liang)(liang)單細(xi)胞基因組學技(ji)術——Microbe-seq很好的解決(jue)了以上問(wen)題，制(zhi)備高通量(liang)(liang)樣本步驟(zou)如(ru)下所述：

1、利用(yong)液滴微(wei)流控技術，將微(wei)生(sheng)物單獨地包裹在含有裂解液的(de)油包水液滴中；

2、在(zai)每(mei)個液(ye)滴(di)中裂解微生物釋放(fang)基因組(zu)DNA，這(zhe)個過程必須保(bao)證(zheng)每(mei)個液(ye)滴(di)中只含有單個微生物；

3、將(jiang)含有裂(lie)解后微(wei)生(sheng)物的(de)液滴轉移(yi)到第(di)二個(ge)微(wei)流控裝置中，與含有擴增試劑的(de)液滴在電場幫助下(xia)合并（并未破裂(lie)）。使(shi)用最為廣(guang)泛應用的(de)MDA擴增法進行全(quan)基因(yin)組(zu)擴增；

4、將液(ye)滴轉(zhuan)移到第三(san)個微(wei)流控裝置，將之(zhi)前的(de)液(ye)滴與第三(san)個裝置中(zhong)含有轉(zhuan)座(zuo)酶等試劑的(de)液(ye)滴合并（并未破裂）。此(ci)步驟可(ke)以將擴增出來的(de)DNA片段化并連(lian)上接頭，隨后(hou)在液(ye)滴中(zhong)用(yong)帶有特定(ding)序列的(de)標簽標記液(ye)滴內DNA；

5、使用第(di)四個微流控裝置將之(zhi)前的(de)液(ye)(ye)滴與(yu)另(ling)一(yi)個含(han)有barcode引物(wu)的(de)磁珠液(ye)(ye)滴合并(bing)。這(zhe)些(xie)引物(wu)包含(han)兩部(bu)分：一(yi)部(bu)分是每(mei)個液(ye)(ye)滴唯一(yi)的(de)barcode序列。另(ling)一(yi)部(bu)分則是對(dui)先前添加的(de)接(jie)頭進(jin)行退火的(de)序列，通(tong)過(guo)PCR將這(zhe)些(xie)barcode引物(wu)連接(jie)到每(mei)個液(ye)(ye)滴內的(de)片段(duan)DNA分子上。

6、最后打破液(ye)滴，將所(suo)有液(ye)滴內的DNA合并，添加測序(xu)接頭(tou)使(shi)用(yong)Illumina平臺進(jin)行測序(xu)。流程示(shi)意(yi)圖如下：

由于每(mei)(mei)一個(ge)液滴內DNA標(biao)記(ji)的標(biao)簽是唯(wei)一的，因此(ci)將測序(xu)得到(dao)的序(xu)列按(an)照(zhao)標(biao)簽進行歸(gui)類即(ji)可得到(dao)每(mei)(mei)一個(ge)液滴內單(dan)個(ge)微(wei)生物(wu)的基因組信息。這些具有相(xiang)同barcode的測序(xu)序(xu)列的集(ji)合即(ji)稱為單(dan)擴增(zeng)基因組single amplified genome (SAG)。

為了驗(yan)證每一個SAG所包含的(de)基因組信(xin)息是否(fou)可信(xin)，作者應用Microbe-seq方法對四種(zhong)已知菌株(zhu)構建了模擬(ni)微生(sheng)物(wu)群落(luo)樣本進行測試(shi)。實驗(yan)共(gong)得到了5497個SAG，用純度來代表每個SAG中單(dan)(dan)微生(sheng)物(wu)基因組的(de)比例，結(jie)果顯示84%的(de)SAG純度超過95%，表明絕(jue)大(da)多數SAG都來自單(dan)(dan)一微生(sheng)物(wu)，如下圖B所示。

作者統計單個SAG包含(han)的(de)(de)基(ji)因(yin)組(zu)信(xin)息的(de)(de)比例后發(fa)現，對于(yu)革(ge)蘭氏陰性菌(jun)(jun)(jun)(jun)大腸桿菌(jun)(jun)(jun)(jun)和(he)(he)肺炎克雷伯菌(jun)(jun)(jun)(jun)，平(ping)均基(ji)因(yin)組(zu)覆蓋(gai)率分(fen)別為(wei)8%和(he)(he)10%；而對于(yu)革(ge)蘭氏陽性菌(jun)(jun)(jun)(jun)枯草芽孢桿菌(jun)(jun)(jun)(jun)和(he)(he)金黃(huang)色葡萄球菌(jun)(jun)(jun)(jun)，比例為(wei)17%和(he)(he)25%，這是由于(yu)革(ge)蘭氏陽性菌(jun)(jun)(jun)(jun)基(ji)因(yin)組(zu)較小導致的(de)(de)基(ji)因(yin)組(zu)覆蓋(gai)率差異(yi)。對于(yu)上述四種(zhong)菌(jun)(jun)(jun)(jun)株，幾十個SAG基(ji)本上包含(han)了(le)微生物基(ji)因(yin)組(zu)的(de)(de)所有信(xin)息，如下圖C所示。

由于模擬(ni)樣(yang)本(ben)實(shi)驗中得(de)知單個SAG涵蓋的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)組(zu)(zu)信息(xi)一般在(zai)全基(ji)(ji)因(yin)組(zu)(zu)的(de)(de)50%以內，無(wu)法(fa)直接被用作該樣(yang)本(ben)的(de)(de)參考(kao)基(ji)(ji)因(yin)組(zu)(zu)，為了獲得(de)高質量(liang)的(de)(de)微(wei)生物群落(luo)的(de)(de)參考(kao)基(ji)(ji)因(yin)組(zu)(zu)，識別單個SAG，作者團(tuan)隊設(she)計了一種不參考(kao)外部基(ji)(ji)因(yin)組(zu)(zu)的(de)(de)生信分析方法(fa)：

1、將同一(yi)物(wu)(wu)種多個(ge)相似SAG進行基因組組裝(zhuang)，然后將平均核苷酸同一(yi)性（ANI）值超過(guo)95%的(de)基因組歸為(wei)同一(yi)物(wu)(wu)種，并將它們的(de)序列進行合并，進而獲得物(wu)(wu)種水平的(de)基因組作為(wei)參(can)考基因組。

2、將單個SAG與得(de)到的參考基因組(zu)進行比對，識別(bie)來(lai)自于(yu)不同菌株的單細胞(bao)微生物并進行基因組(zu)組(zu)裝(zhuang)。

Microbe-seq技術流(liu)程示意圖(tu)

文(wen)中(zhong)實(shi)驗選取了從1名健(jian)康受試者收集的7份縱(zong)向(xiang)糞便(bian)樣本，獲得了21914個單擴增基(ji)因(yin)組(zu)(SAG)，其(qi)中(zhong)從每個樣本中(zhong)得到了約1000-7000個SAG，每個SAG平均包(bao)含約70000條序列。與同源樣本宏(hong)基(ji)因(yin)組(zu)結果相(xiang)比，這些(xie)SAG捕(bu)獲了相(xiang)似水平的物種(zhong)基(ji)因(yin)組(zu)。

1、構建高(gao)質量(liang)人體腸道(dao)微生物樣本參(can)考基因組

在這個健康(kang)人(ren)的(de)腸道(dao)微(wei)生物樣本中(zhong)(zhong)，通過Microbe-seq共(gong)組裝得到(dao)76個物種(zhong)的(de)基(ji)因組，其中(zhong)(zhong)52個物種(zhong)具有(you)高質(zhi)(zhi)量基(ji)因組（完(wan)(wan)整(zheng)(zheng)性(xing)(xing)>0.9，污染(ran)<0.05），24個物種(zhong)具有(you)中(zhong)(zhong)等質(zhi)(zhi)量基(ji)因組（完(wan)(wan)整(zheng)(zheng)性(xing)(xing)> 0.5和污染(ran)<0.1）。超(chao)過四(si)分之(zhi)三的(de)SAG屬于這76個物種(zhong)中(zhong)(zhong)的(de)一個，表明Microbe-seq得到(dao)的(de)大部分SAG的(de)可以(yi)用(yong)于構建獨立的(de)參考(kao)基(ji)因組。

通過與(yu)同(tong)源樣本分(fen)離培(pei)(pei)養細菌的(de)(de)基因(yin)組(zu)(zu)結果進行比較，發(fa)現76個物(wu)(wu)種中(zhong)有(you)19個物(wu)(wu)種被成功分(fen)離培(pei)(pei)養。在這19個物(wu)(wu)種中(zhong)，有(you)17個物(wu)(wu)種的(de)(de)組(zu)(zu)裝基因(yin)組(zu)(zu)與(yu)分(fen)離培(pei)(pei)養得到(dao)的(de)(de)基因(yin)組(zu)(zu)高度一致，表明Microbe-seq可以(yi)獲得與(yu)分(fen)離培(pei)(pei)養相似水平(ping)的(de)(de)可靠基因(yin)組(zu)(zu)。

由核糖體蛋白序列構建的76種細菌的系統發育由圓中心的樹狀圖表示

注：外圈柱子長度代表在其(qi)組裝基(ji)因組過(guo)程中(zhong)使用的SAG數目(mu)。星號標記的是(shi)19個具有相(xiang)應(ying)分(fen)離株的基(ji)因組

將每(mei)個(ge)樣本中所有 SAG的所有reads模擬宏(hong)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)學中產生(sheng)的數據與(yu)微(wei)生(sheng)物基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)公(gong)共數據庫進行(xing)比(bi)較(jiao)，對(dui)每(mei)個(ge)樣本中的每(mei)個(ge)read進行(xing)分類，與(yu)同(tong)源(yuan)樣本宏(hong)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)微(wei)生(sheng)物多樣性(xing)結果(guo)做對(dui)比(bi)，發現通過Microbe-seq檢測到的屬與(yu)宏(hong)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)結果(guo)重合(he)度高達(da)96.9%-99.8%。由于與(yu)宏(hong)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)的裂解方(fang)式不同(tong)，導致革蘭(lan)氏陽性(xing)菌(如厚壁菌門(men)和(he)放(fang)線菌門(men))的比(bi)例過高而(er)革蘭(lan)氏陰性(xing)菌(尤其是擬桿(gan)菌門(men)和(he)變形菌門(men))的比(bi)例相對(dui)較(jiao)低，但同(tong)一(yi)個(ge)門(men)內(nei)的微(wei)生(sheng)物的豐度趨勢在兩種方(fang)法中一(yi)致，表明Microbe-seq可獲得與(yu)宏(hong)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)一(yi)致的微(wei)生(sheng)物多樣性(xing)。

7個縱向樣本使用Microbe-seq與宏基因組方法的微生物多樣性比對結果

2、精準解析菌株水平的(de)基因組信息，發現新菌株

為了(le)區(qu)分菌株，作者(zhe)團隊開發了(le)一(yi)種(zhong)利(li)用 SAG之間同源序列(lie)差異(yi)的(de)(de)(de)方法：將SAG重新(xin)比對(dui)(dui)到物種(zhong)水(shui)平的(de)(de)(de)組(zu)(zu)(zu)裝(zhuang)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)，可(ke)以(yi)得到基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)中(zhong)所(suo)(suo)有(you)SNP位點(dian)在該SAG的(de)(de)(de)reads中(zhong)出現的(de)(de)(de)比例。同一(yi)菌株的(de)(de)(de)微生物具有(you)幾乎相同的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)，因(yin)(yin)此代表(biao)同一(yi)菌株的(de)(de)(de)兩個(ge)SAG幾乎總是在兩個(ge)SAG共享的(de)(de)(de)每(mei)個(ge)SNP位點(dian)具有(you)相同的(de)(de)(de)堿基(ji)；相反，代表(biao)不同菌株的(de)(de)(de)SAG顯(xian)示出相當低(di)的(de)(de)(de)相似性。依照SNP信息對(dui)(dui)普通似桿(gan)菌的(de)(de)(de)SAG進(jin)行層次(ci)聚類(lei)(lei)分析并進(jin)行降維可(ke)視化所(suo)(suo)有(you)SAG對(dui)(dui)之間的(de)(de)(de)SNP相似性，發現SAG分為四個(ge)明(ming)顯(xian)分離的(de)(de)(de)聚類(lei)(lei)簇：將SAG最多(duo)的(de)(de)(de)兩組(zu)(zu)(zu)高質量(liang)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)其標記為候選菌株A和B；一(yi)個(ge)中(zhong)等質量(liang)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)C；以(yi)及(ji)另外一(yi)個(ge)質量(liang)較低(di)的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)D，如下圖(tu)A：

分(fen)(fen)析SAG最(zui)多的(de)(de)兩個(ge)(ge)簇(cu)(cu)，發現每個(ge)(ge)普通似(si)桿(gan)菌(jun)的(de)(de)SAG聚類簇(cu)(cu)具有(you)一致(zhi)的(de)(de)基(ji)因(yin)型，而(er)與其它SAG簇(cu)(cu)的(de)(de)基(ji)因(yin)型重疊程(cheng)度很低，這說(shuo)明(ming)每個(ge)(ge)SAG聚類簇(cu)(cu)代表(biao)不(bu)同的(de)(de)菌(jun)株，如下圖B。其中，菌(jun)株A和菌(jun)株C與分(fen)(fen)離(li)培養(yang)的(de)(de)兩個(ge)(ge)菌(jun)株的(de)(de)基(ji)因(yin)組(zu)(zu)一致(zhi)，菌(jun)株B為鑒定到的(de)(de)全新菌(jun)株，這些結果強有(you)力地證明(ming)了Microbe-seq能夠正(zheng)確鑒定出已知菌(jun)株和尚未培養(yang)的(de)(de)潛在新菌(jun)株，同時實現其基(ji)因(yin)組(zu)(zu)的(de)(de)精確組(zu)(zu)裝(zhuang)。

進一(yi)步將(jiang)這種(zhong)(zhong)(zhong)基(ji)于 SNP的(de)(de)(de)分(fen)析應(ying)用于具有(you)(you)高質量或中(zhong)(zhong)等質量物(wu)種(zhong)(zhong)(zhong)水(shui)平基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)的(de)(de)(de)剩余物(wu)種(zhong)(zhong)(zhong)，在該個(ge)體(ti)的(de)(de)(de)76個(ge)微生物(wu)物(wu)種(zhong)(zhong)(zhong)中(zhong)(zhong)，作(zuo)者團隊總(zong)計發現了10個(ge)具有(you)(you)多(duo)個(ge)不同的(de)(de)(de)菌(jun)株的(de)(de)(de)物(wu)種(zhong)(zhong)(zhong)，并且組(zu)(zu)裝了對應(ying)的(de)(de)(de)菌(jun)株水(shui)平的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)。在前(qian)文中(zhong)(zhong)提到的(de)(de)(de)19個(ge)已(yi)經被成功分(fen)離培養(yang)的(de)(de)(de)物(wu)種(zhong)(zhong)(zhong)中(zhong)(zhong)，有(you)(you)兩個(ge)物(wu)種(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)共組(zu)(zu)裝基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)與培養(yang)測序所(suo)得的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)具有(you)(you)一(yi)定偏差，而(er)這兩種(zhong)(zhong)(zhong)物(wu)種(zhong)(zhong)(zhong)都具有(you)(you)多(duo)個(ge)菌(jun)株，這也解釋了共組(zu)(zu)裝基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)與培養(yang)測序基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)存在偏差的(de)(de)(de)原因(yin)(yin)(yin)，如下圖(tu)C。

識別每個(ge) SAG菌(jun)株(zhu)的(de)(de)能力(li)能夠輔(fu)助追蹤這些(xie)菌(jun)株(zhu)隨時間的(de)(de)推移在人類供體(ti)中(zhong)的(de)(de)相對豐(feng)(feng)度，從而(er)深入(ru)了解細菌(jun)種(zhong)群(qun)動態。在收集樣本的(de)(de)一年(nian)半中(zhong)，這些(xie)菌(jun)株(zhu)的(de)(de)豐(feng)(feng)度變化幅(fu)度不(bu)(bu)大。例如，作者團(tuan)隊在第400天(tian)左右連續收集的(de)(de)兩個(ge)樣本中(zhong)觀察到菌(jun)株(zhu)B的(de)(de)豐(feng)(feng)度非常相似(si)，如下圖(tu)D所示。這些(xie)觀察結果表明不(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)擬(ni)桿菌(jun)門物(wu)種(zhong)可以穩定地在人體(ti)腸道定殖數十(shi)年(nian)，并且(qie)相同(tong)擬(ni)桿菌(jun)門物(wu)種(zhong)的(de)(de)不(bu)(bu)同(tong)菌(jun)株(zhu)可以以穩定的(de)(de)相對豐(feng)(feng)度共存。

3、重建菌株的水平基因轉移現象

微生物研究(jiu)中(zhong)(zhong)一個特別值得(de)注(zhu)意的(de)課(ke)題是研究(jiu)微生物如何交換遺傳信息(xi)，其(qi)中(zhong)(zhong)最著名的(de)機制之一是菌(jun)株(zhu)的(de)水平基(ji)因轉移（HGT）現象。

將來自兩個物種(zhong)(zhong)的(de)(de)基(ji)因組之(zhi)間的(de)(de) HGT事件定義為存在至少(shao)5 kb且具有(you)99.98%相似性的(de)(de)共同(tong)序列。作者(zhe)將這些(xie)標準應用于所(suo)有(you)57個高質量(liang)菌(jun)(jun)(jun)株分辨(bian)基(ji)因組，過濾掉SAG合并造成(cheng)的(de)(de)潛在污染，并觀(guan)察來自不(bu)同(tong)物種(zhong)(zhong)的(de)(de)90對菌(jun)(jun)(jun)株之(zhi)間的(de)(de)265個HGT序列，共發(fa)現了66個單個個體(ti)腸道微生(sheng)物群中HGT現象，且同(tong)一門中的(de)(de)菌(jun)(jun)(jun)株之(zhi)間的(de)(de)轉(zhuan)移明顯大于不(bu)同(tong)門中的(de)(de)菌(jun)(jun)(jun)株之(zhi)間的(de)(de)轉(zhuan)移：65對菌(jun)(jun)(jun)株在厚壁菌(jun)(jun)(jun)門內(nei)，25對菌(jun)(jun)(jun)株在擬(ni)桿菌(jun)(jun)(jun)門內(nei)。如(ru)下圖：

Faecalicatena faecis菌株與(yu)不同的菌種(zhong)交(jiao)換(huan)了基因，而兩株普通芽孢桿菌只與(yu)其他六個相(xiang)同的類桿菌菌種(zhong)交(jiao)換(huan)基因

4、菌株水(shui)平的宿(su)主-噬菌體關(guan)聯

基(ji)于微流控(kong)液滴的(de)(de)方法不(bu)僅封裝(zhuang)(zhuang)了(le)單個(ge)細菌(jun)，還(huan)封裝(zhuang)(zhuang)了(le)與(yu)之物(wu)理(li)共處的(de)(de)噬(shi)菌(jun)體(ti)(ti)。本(ben)次實驗檢測到了(le)crAssphage的(de)(de)存在，crAssphage是目前從人(ren)體(ti)(ti)腸道(dao)微生(sheng)物(wu)組(zu)(zu)中發現的(de)(de)最豐富的(de)(de)噬(shi)菌(jun)體(ti)(ti)。為了(le)探索(suo)微生(sheng)物(wu)與(yu)噬(shi)菌(jun)體(ti)(ti)之間的(de)(de)關聯(lian)，作者團隊將每(mei)個(ge)SAG中的(de)(de)reads與(yu)crAssphage基(ji)因組(zu)(zu)進行比較，發現數十個(ge)SAG包(bao)含很大一部分(fen)reads可(ke)以與(yu)crAssphage匹(pi)配，且這些SAG還(huan)包(bao)含大量不(bu)與(yu)crAssphage基(ji)因組(zu)(zu)匹(pi)配的(de)(de)reads，而是與(yu)細菌(jun)分(fen)類群(qun)匹(pi)配，將這些reads與(yu)76個(ge)物(wu)種(zhong)的(de)(de)組(zu)(zu)裝(zhuang)(zhuang)基(ji)因組(zu)(zu)進行比對，以確定哪(na)些細菌(jun)物(wu)種(zhong)可(ke)能與(yu)該人(ren)類供體(ti)(ti)中的(de)(de)crAssphage菌(jun)株(zhu)相關。

在這(zhe)幾十個包含相(xiang)(xiang)當一部分與crAssphage匹配的序(xu)列的SAG中(zhong)，有(you)14個SAG只與一個物種--普(pu)(pu)通擬桿(gan)菌(jun)相(xiang)(xiang)關。證明普(pu)(pu)通似桿(gan)菌(jun)是該(gai)個體(ti)(ti)中(zhong)噬菌(jun)體(ti)(ti)crAssphage的體(ti)(ti)內宿主物種，如下圖(tu)A。圖(tu)B則更(geng)精(jing)確地顯(xian)示(shi)了普(pu)(pu)通似桿(gan)菌(jun)菌(jun)株A與噬菌(jun)體(ti)(ti)crAssphage存在明顯(xian)的關聯。

Microbe-seq技(ji)術將微流(liu)控技(ji)術應用于(yu)微生物領(ling)域，配(pei)合特殊的生物信(xin)息學(xue)分析手段，無(wu)需傳統手段或前(qian)參考即可以精(jing)準地組裝(zhuang)出高質量的菌(jun)株水平基(ji)因(yin)組。同(tong)時(shi)，該(gai)技(ji)術還可精(jing)確解析菌(jun)株水平基(ji)因(yin)組、發現未培養的潛在的新菌(jun)株，在菌(jun)株水平探(tan)究水平基(ji)因(yin)轉移現象(xiang)、宿主-噬菌(jun)體關聯、功能基(ji)因(yin)和代謝通路(lu)問題。

單細胞(bao)技術在微(wei)生(sheng)物領域中具有廣(guang)泛的(de)研究前(qian)景，無論(lun)是(shi)土壤還(huan)是(shi)海洋，亦或是(shi)是(shi)植物與動物中的(de)微(wei)生(sheng)物，該文章為(wei)廣(guang)大微(wei)生(sheng)物學者們打(da)開了(le)(le)新思路、提供了(le)(le)新方(fang)法(fa)，Microbe-seq有望成為(wei)單細胞(bao)微(wei)生(sheng)物研究的(de)主流技術，從自(zi)然菌群中完(wan)成單細胞(bao)測序(xu)及分析研究的(de)那(nei)一天已經(jing)指日(ri)可(ke)待了(le)(le)。