2022-09-07
背景介紹
近年(nian)來(lai)，基(ji)因(yin)(yin)編(bian)輯(ji)技術、RNAi技術、合成生(sheng)物學等轉基(ji)因(yin)(yin)新(xin)技術飛速發展(zhan)，特(te)別是2020年(nian)獲得諾(nuo)貝爾化學獎的基(ji)因(yin)(yin)編(bian)輯(ji)技術——間(jian)隔規律成簇短回文重復序列(lie)及關聯蛋白(bai)（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/CRISPR‐associated proteins，CRISPR/Cas），已經成為最熱門的轉基(ji)因(yin)(yin)工具(ju)，為基(ji)因(yin)(yin)功能研(yan)究開(kai)創了新(xin)局面(mian)。 基因(yin)編(bian)輯(ji)依賴于經(jing)過改造的(de)(de)(de)核(he)酸(suan)酶，核(he)酸(suan)酶在(zai)基因(yin)組中(zhong)特(te)定位置(zhi)產(chan)(chan)生位點特(te)異性雙鏈斷裂（double strand break，DSB），誘(you)導生物體通過同源重組（homologous recombination，HR）或非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）的(de)(de)(de)方(fang)式來修(xiu)(xiu)復 DSB（如下(xia)(xia)圖所示(shi)）。HR修(xiu)(xiu)復的(de)(de)(de)效率很(hen)低，因(yin)為需要(yao)有同源片段的(de)(de)(de)存在(zai)，以(yi)(yi)其為模板才能進行修(xiu)(xiu)復。而 NHEJ修(xiu)(xiu)復，不需要(yao)模板，修(xiu)(xiu)復過程容(rong)易出錯，從而實現靶點的(de)(de)(de)堿(jian)基替換、缺失以(yi)(yi)及插入等。同時相比于轉(zhuan)基因(yin)產(chan)(chan)品(pin)(pin)而言，基因(yin)編(bian)輯(ji)技(ji)術(shu)在(zai)受(shou)體生物內留下(xia)(xia)的(de)(de)(de)痕跡較少，傳統的(de)(de)(de)轉(zhuan)基因(yin)檢(jian)測技(ji)術(shu)很(hen)難滿足(zu)基因(yin)編(bian)輯(ji)產(chan)(chan)品(pin)(pin)的(de)(de)(de)檢(jian)測，特(te)別是(shi)NHEJ這(zhe)類只涉及少量堿(jian)基改變的(de)(de)(de)產(chan)(chan)品(pin)(pin)。因(yin)此，需要(yao)加(jia)強檢(jian)測新(xin)技(ji)術(shu)的(de)(de)(de)研究(jiu)，建立(li)針對基因(yin)編(bian)輯(ji)產(chan)(chan)品(pin)(pin)等新(xin)技(ji)術(shu)產(chan)(chan)品(pin)(pin)的(de)(de)(de)檢(jian)測方(fang)法。
派森諾基于(yu)目(mu)前基因編(bian)輯技術的(de)特點(dian)以及現(xian)有傳統檢(jian)測技術的(de)局限性(xing)，開(kai)發(fa)了一種(zhong)基于(yu)二(er)代測序的(de)高通量檢(jian)測變異(yi)位點(dian)類型的(de)檢(jian)測技術- HTRM-Seq。 技術路線如下圖： 技術優勢如下表： 在編(bian)輯位點與(yu)(yu)序(xu)列已知的情況(kuang)下，與(yu)(yu)目前(qian)的檢測方法比(bi)較分(fen)析： 數據分析優勢如下： 推(tui)薦使(shi)用CRISPResso2分(fen)(fen)析(xi)(xi)，若需要更(geng)加深入或個性(xing)化分(fen)(fen)析(xi)(xi)，我們可以提供更(geng)加專業的(de)生(sheng)信(xin)分(fen)(fen)析(xi)(xi)平臺。 HTRM-Seq實測案例如下： HTRM-Seq：實(shi)驗成功率(lv)比較分析 我們選取了41份單基因突變的煙草轉基因植株，使用相同提取方法進行提取，分別使用基于一代測序的傳統檢測技術以及HTRM-Seq對樣本進行擴增檢測測序（備注：模(mo)板投入量、擴(kuo)增(zeng)酶、擴(kuo)增(zeng)體(ti)系擴(kuo)增(zeng)程序均相同）。其中傳統檢測技術，41份DNA均一次擴增成功，平均的PCR產物濃度3-5ng/ul，上一代測序平臺31份有數據產出，10份由于熒光信號弱測序失敗；而HTRM-Seq，41份DNA均一次性建庫成功且有數據產物，平均PCR產物濃度1-3ng/ul（如下圖所示）。由此可以得出，前期不管是傳統檢測手段還是HTRM-Seq，擴增成功率均基本一致，但是對測序前PCR產物的濃度要求，HTRM-Seq比傳統檢測手段要更低，進而提高樣本的轉化效率。 HTRM-Seq：測序精準(zhun)度比較分析(xi) 我們選取了純野生型煙草種子以及混合種子（野生型+突變型，野生型占多數），使用相同提取方法進行提取，分別使用基于一代測序的傳統檢測手段以及HTRM-Seq對樣本進行擴增檢測測序（備注：模板(ban)投(tou)入量、擴增(zeng)酶、擴增(zeng)體系擴增(zeng)程序(xu)均相(xiang)同）。數據分析結果顯示：對于純野生型的檢測，HTRM-Seq與傳統檢測結果一致（如下圖-A）；但是對于低頻突變或混合檢測，HTRM-Seq能夠區分不同的突變類型，而傳統檢測不行（如下圖-B）。從而可以得出：對于高頻率的純合突變類型來說，HTRM-Seq與傳統檢測精準度基本一致；但是對于低頻率的突變類型或混樣來說，HTRM-Seq更具有優勢。 HTRM-Seq：大批量樣本檢測(ce)的快速性 我們(men)選取了純野生(sheng)型(xing)煙草（CT）與純合突變型(xing)煙草（C），使用HTRM-Seq對(dui)樣本(ben)(ben)進(jin)行擴增(zeng)檢(jian)測測序(xu)，上(shang)機時對(dui)同(tong)一(yi)批(pi)次樣本(ben)(ben)進(jin)行梯(ti)度（1x、10x、100x稀釋）上(shang)機。數據(ju)結果分(fen)析發現，HTRM-seq技術在不影響檢(jian)測精度的前(qian)提下，有效數據(ju)量(liang)(liang)可以(yi)降低到(dao)一(yi)定范圍(wei)內，提高了檢(jian)測的通量(liang)(liang)，大量(liang)(liang)的樣本(ben)(ben)也(ye)可以(yi)一(yi)次性(xing)檢(jian)測，進(jin)而可以(yi)進(jin)一(yi)步縮短項(xiang)目周期。 綜(zong)合上(shang)述，相(xiang)比較(jiao)傳統(tong)檢(jian)測技術，可以發現(xian)HTRM-Seq不(bu)管是在檢(jian)測精準度的方面，還是在數據分析的便捷(jie)性以及適用性范圍方面，均占據一定(ding)的優勢，是檢(jian)測大批(pi)量基(ji)因編輯(ji)樣本(ben)的不(bu)二之(zhi)選。
