肝(gan)(gan)臟(zang)是一個高度(du)異(yi)質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)器官(guan)，具有代謝、解毒、造血、分(fen)(fen)泌(mi)(mi)膽汁等功(gong)能。肝(gan)(gan)臟(zang)由無數大小(xiao)、形態相(xiang)(xiang)似的(de)(de)(de)肝(gan)(gan)小(xiao)葉(xie)（Liver lobule）組(zu)成，其(qi)中門(men)靜(jing)脈(mo)(mo)（PV）位于鄰近肝(gan)(gan)小(xiao)葉(xie)間的(de)(de)(de)連(lian)接處，富含營(ying)養的(de)(de)(de)血液經門(men)靜(jing)脈(mo)(mo)由腸(chang)道(dao)進(jin)入肝(gan)(gan)臟(zang)，而耗盡養分(fen)(fen)及(ji)氧氣(qi)的(de)(de)(de)血液則(ze)經中央(yang)靜(jing)脈(mo)(mo)（CV）排出。正(zheng)常情況下，肝(gan)(gan)臟(zang)通過(guo)其(qi)組(zu)織(zhi)內的(de)(de)(de)成千上萬的(de)(de)(de)肝(gan)(gan)小(xiao)葉(xie)完成其(qi)復(fu)雜的(de)(de)(de)功(gong)能。血液首先進(jin)入小(xiao)葉(xie)的(de)(de)(de)角落，稱(cheng)為“門(men)脈(mo)(mo)節點”，并通過(guo)竇性通道(dao)流入引(yin)流的(de)(de)(de)中央(yang)靜(jing)脈(mo)(mo) (CV)。這種極化的(de)(de)(de)血流與(yu)肝(gan)(gan)細(xi)胞的(de)(de)(de)連(lian)續消(xiao)耗和(he)分(fen)(fen)泌(mi)(mi)相(xiang)(xiang)結合(he)，產生氧氣(qi)、營(ying)養物質(zhi)(zhi)和(he)激素的(de)(de)(de)梯度(du)分(fen)(fen)布，導致高度(du)異(yi)質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)微(wei)環境，因此肝(gan)(gan)臟(zang)中不同位置的(de)(de)(de)細(xi)胞在基(ji)因表達上呈現顯著差異(yi)，約一半的(de)(de)(de)肝(gan)(gan)細(xi)胞基(ji)因是呈帶狀(zhuang)分(fen)(fen)布的(de)(de)(de)，例如糖異(yi)生和(he)蛋白質(zhi)(zhi)分(fen)(fen)泌(mi)(mi)等過(guo)程(cheng)(cheng)是由門(men)靜(jing)脈(mo)(mo)周圍(wei)肝(gan)(gan)細(xi)胞負(fu)責，其(qi)他過(guo)程(cheng)(cheng)如藥物解毒則(ze)由中心(xin)周圍(wei)肝(gan)(gan)細(xi)胞發揮功(gong)能，該現象(xiang)稱(cheng)為“肝(gan)(gan)臟(zang)分(fen)(fen)區”，目前尚不清楚這種空(kong)間異(yi)質(zhi)(zhi)性如何影響肝(gan)(gan)臟(zang)病(bing)理和(he)再生過(guo)程(cheng)(cheng)。

此(ci)外，肝(gan)(gan)臟(zang)也是再(zai)生(sheng)(sheng)能力(li)最強的(de)(de)器官之(zhi)一。在急(ji)性(xing)劑量的(de)(de)藥物作用下(xia)，試圖解(jie)毒這些外來(lai)物質的(de)(de)中(zhong)心(xin)周圍肝(gan)(gan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)被(bei)有(you)毒中(zhong)間體淹沒而死(si)亡。剩下(xia)的(de)(de)肝(gan)(gan)組(zu)織(zhi)進入再(zai)生(sheng)(sheng)模式，導致受損的(de)(de)小葉層迅(xun)速愈(yu)合和替(ti)換。分(fen)區再(zai)生(sheng)(sheng)涉及一系列(lie)相互協調(diao)的(de)(de)過(guo)程，對反應有(you)嚴格的(de)(de)時空(kong)控制要(yao)(yao)求(qiu)。死(si)亡的(de)(de)肝(gan)(gan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)需(xu)要(yao)(yao)被(bei)有(you)效清除，防止多(duo)種(zhong)新(xin)(xin)抗原暴露以(yi)(yi)誘導適應性(xing)免(mian)疫系統。細(xi)胞(bao)(bao)(bao)外基(ji)質需(xu)要(yao)(yao)被(bei)快速構建以(yi)(yi)支(zhi)持組(zu)織(zhi)支(zhi)架(jia)，但一旦(dan)新(xin)(xin)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)形成就要(yao)(yao)分(fen)解(jie)，以(yi)(yi)防止持久的(de)(de)纖維化。最重要(yao)(yao)的(de)(de)是，起(qi)源于小葉區表(biao)達特征截(jie)然不同的(de)(de)肝(gan)(gan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)需(xu)要(yao)(yao)快速生(sheng)(sheng)成和重新(xin)(xin)編(bian)程，以(yi)(yi)接(jie)管中(zhong)心(xin)周圍肝(gan)(gan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)關鍵功能。目前，在整個分(fen)區再(zai)生(sheng)(sheng)過(guo)程中(zhong)，肝(gan)(gan)臟(zang)組(zu)織(zhi)各細(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型(xing)的(de)(de)協調(diao)反應的(de)(de)時空(kong)動力(li)學仍亟待(dai)探索。

本文利用單細(xi)胞(bao)轉(zhuan)錄(lu)(lu)組、轉(zhuan)錄(lu)(lu)組聯合空間轉(zhuan)錄(lu)(lu)組測序(xu)技術(shu)解析急性(xing)損(sun)傷(shang)后肝(gan)臟(zang)不同區域再生(sheng)(sheng)的(de)時(shi)空程(cheng)(cheng)序(xu)性(xing)調(diao)控過(guo)程(cheng)(cheng)，發現肝(gan)細(xi)胞(bao)在小葉內增(zeng)殖以迅速(su)產生(sheng)(sheng)缺失的(de)細(xi)胞(bao)，新進(jin)的(de)中心周圍(wei)肝(gan)細(xi)胞(bao)在分(fen)區內重新編程(cheng)(cheng)，改變形態，提(ti)高蛋(dan)白質周轉(zhuan)并上調(diao)癌胚基因。非實(shi)質細(xi)胞(bao)通過(guo)區域相關的(de)因素對該(gai)過(guo)程(cheng)(cheng)進(jin)行協調(diao)。本研究的(de)開(kai)展(zhan)促(cu)進(jin)了人類(lei)對于肝(gan)再生(sheng)(sheng)過(guo)程(cheng)(cheng)的(de)區域性(xing)協調(diao)程(cheng)(cheng)序(xu)的(de)理(li)解。

一、肝臟組織再生的細胞圖譜

本研究(jiu)在(zai)小(xiao)鼠(shu)(shu)體(ti)內注射(she)乙酰氨基酚(fen)（APAP，急(ji)性肝臟(zang)損(sun)(sun)傷(shang)誘導劑）后以(yi)引發(fa)小(xiao)鼠(shu)(shu)肝臟(zang)損(sun)(sun)傷(shang)模型(xing)，并(bing)(bing)在(zai)多個時間(jian)(jian)點對肝臟(zang)進行采樣，通(tong)過(guo)RNA測(ce)序（bulk RNA-seq）、單(dan)細胞(bao)RNA測(ce)序（scRNA-seq）、Visium空間(jian)(jian)轉(zhuan)錄(lu)組(zu)(zu)學分(fen)析(xi)以(yi)揭示肝臟(zang)組(zu)(zu)織(zhi)再生的(de)(de)分(fen)子機(ji)制（圖1A）。bulk轉(zhuan)錄(lu)組(zu)(zu)分(fen)析(xi)了不(bu)同(tong)時間(jian)(jian)點的(de)(de)生物學通(tong)路變化、并(bing)(bing)且利(li)用單(dan)細胞(bao)數據(ju)解卷積bulk數據(ju)分(fen)析(xi)細胞(bao)比例的(de)(de)變化，空間(jian)(jian)轉(zhuan)錄(lu)組(zu)(zu)分(fen)析(xi)細胞(bao)的(de)(de)位置(zhi)變化與空間(jian)(jian)基因特(te)征。通(tong)過(guo)注射(she)APAP后不(bu)同(tong)時間(jian)(jian)點的(de)(de)肝小(xiao)葉成(cheng)像(xiang)發(fa)現，大量(liang)的(de)(de)中(zhong)心(xin)周圍(wei)壞(huai)死(si)在(zai)48小(xiao)時后達到峰值。損(sun)(sun)傷(shang)的(de)(de)中(zhong)心(xin)周圍(wei)區域在(zai)72小(xiao)時后出(chu)現收(shou)縮，出(chu)現新的(de)(de)中(zhong)心(xin)周圍(wei)肝細胞(bao)，在(zai)96h后完(wan)全取代壞(huai)死(si)組(zu)(zu)織(zhi)（圖1B）。

bulk RNA-seq數據的(de)通(tong)路(lu)分析顯示，早(zao)期(qi)免疫信號的(de)誘導，在APAP后(hou)6和(he)24小時達(da)到(dao)峰值(zhi)，增殖通(tong)路(lu)在APAP后(hou)48 h達(da)到(dao)高峰。肝臟代謝(xie)(xie)功(gong)能(neng)，如(ru)谷胱甘肽和(he)細(xi)胞色素P450代謝(xie)(xie)，以(yi)及靜(jing)止的(de)造血干細(xi)胞功(gong)能(neng)，在APAP后(hou)72 h重新出現（圖S1C）。

本研究從6個時(shi)間(jian)點（control、24h、48h、72h、96h和(he)1w）的(de)28只小(xiao)鼠的(de)肝(gan)(gan)(gan)(gan)臟中(zhong)共獲得 23944個單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，注釋為11種細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類型(xing)（包(bao)括肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、內(nei)皮細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，肝(gan)(gan)(gan)(gan)星(xing)狀細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，Kupffer細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，單(dan)(dan)核細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，巨噬細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)等）(圖(tu)1C1D)，利用單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)數(shu)據(ju)解(jie)卷積bulk數(shu)據(ju)量化(hua)肝(gan)(gan)(gan)(gan)臟損傷再生過程中(zhong)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)組(zu)成(cheng)比例的(de)動(dong)態變化(hua)，發現(xian)在(zai)APAP注射(she)48小(xiao)時(shi)后(hou)(hou)肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)數(shu)量顯著降低、細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)壞死達到(dao)(dao)峰值，然而注射(she)96小(xiao)時(shi)后(hou)(hou)可逆轉到(dao)(dao)正(zheng)常水(shui)(shui)平。相反，肝(gan)(gan)(gan)(gan)星(xing)狀細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，單(dan)(dan)核細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)巨噬細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)數(shu)量隨著損傷逐漸增加，到(dao)(dao)注射(she)24-48小(xiao)時(shi)后(hou)(hou)達到(dao)(dao)峰值，隨后(hou)(hou)又慢(man)慢(man)恢(hui)(hui)復到(dao)(dao)正(zheng)常水(shui)(shui)平（圖(tu)S1D）。Kupffer細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)內(nei)皮細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)在(zai)48小(xiao)時(shi)時(shi)增殖達到(dao)(dao)高峰，但(dan)并沒有出(chu)現(xian)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)豐度(du)的(de)增加，提示可能除了肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)外，一些(xie)Kupffer細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)內(nei)皮細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)在(zai)急性損傷期間(jian)死亡，并通(tong)過增殖來維持數(shu)量（圖(tu)S1E），該分析顯示出(chu)肝(gan)(gan)(gan)(gan)臟基因表達和(he)多種肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類型(xing)比例的(de)重(zhong)大變化(hua)，在(zai)損傷后(hou)(hou)4天就迅速恢(hui)(hui)復到(dao)(dao)控制水(shui)(shui)平。

Figure 1. 肝臟組(zu)織再生的細胞圖譜

Figure S1. 肝臟組織再生過程中的時間動態變化

二、肝細胞再生過程中區域性重編程和跨肝小葉的廣泛增殖

中心(xin)周圍(wei)(wei)和門靜脈周圍(wei)(wei)肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)在(zai)未受干擾(rao)的(de)(de)肝(gan)(gan)(gan)(gan)臟(zang)中表現(xian)出(chu)明(ming)顯不同(tong)的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)表達模(mo)式(shi)，Bulk RNA-seq數(shu)據(ju)分(fen)析表明(ming)，肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)特異性基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)轉錄(lu)(lu)在(zai)早期時(shi)(shi)(shi)間點偏離對照(zhao)(zhao)，但在(zai)注射APAP后(hou)(hou)96小時(shi)(shi)(shi)恢(hui)復到(dao)對照(zhao)(zhao)水(shui)平（圖(tu)(tu)2A）。單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)數(shu)據(ju)中包括來自對照(zhao)(zhao)、APAP 注射后(hou)(hou) 48 和 72 小時(shi)(shi)(shi)的(de)(de) 2,770 個肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)（圖(tu)(tu)2B）。通(tong)過(guo)進一(yi)(yi)步深入分(fen)析損(sun)傷后(hou)(hou)肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)轉錄(lu)(lu)組(zu)和空間轉錄(lu)(lu)組(zu)數(shu)據(ju)（圖(tu)(tu)S2H），獲得了肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)再(zai)生過(guo)程(cheng)肝(gan)(gan)(gan)(gan)小葉(xie)帶(dai)(dai)(dai)狀(zhuang)(zhuang)分(fen)布的(de)(de)不同(tong)空間位置的(de)(de)坐(zuo)標基(ji)(ji)因(yin)，從而將沿肝(gan)(gan)(gan)(gan)小葉(xie)軸空間分(fen)成三個帶(dai)(dai)(dai)狀(zhuang)(zhuang)區域：中心(xin)周圍(wei)(wei)區（pericentral）、小葉(xie)中區（midlobular）和門靜脈周圍(wei)(wei)區（periportal zones），并重建了肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)再(zai)生過(guo)程(cheng)的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)空間帶(dai)(dai)(dai)狀(zhuang)(zhuang)表達圖(tu)(tu)譜。正(zheng)如預期一(yi)(yi)樣，中心(xin)周圍(wei)(wei)肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)在(zai)48小時(shi)(shi)(shi)被耗盡。在(zai)72小時(shi)(shi)(shi)，帶(dai)(dai)(dai)狀(zhuang)(zhuang)坐(zuo)標的(de)(de)分(fen)布接近(jin)損(sun)傷前的(de)(de)模(mo)式(shi)（圖(tu)(tu)2C2D2E2F）。進一(yi)(yi)步利用單分(fen)子熒光原位雜交(jiao)（smFISH）驗證了該肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)再(zai)生帶(dai)(dai)(dai)狀(zhuang)(zhuang)圖(tu)(tu)譜的(de)(de)帶(dai)(dai)(dai)狀(zhuang)(zhuang)基(ji)(ji)因(yin)，如中心(xin)區的(de)(de)Glul和Cyp2e1以(yi)及門靜脈周的(de)(de)Ass1，在(zai)損(sun)傷再(zai)生過(guo)程(cheng)存在(zai)明(ming)顯的(de)(de)帶(dai)(dai)(dai)狀(zhuang)(zhuang)模(mo)式(shi)（圖(tu)(tu)2G2H）。

為了研究呈帶(dai)狀(zhuang)分(fen)布的不(bu)同(tong)肝(gan)細(xi)(xi)胞(bao)亞(ya)群對于(yu)損(sun)(sun)傷再(zai)生的增值響應能力是否有差異(yi)，使用smFISH定量檢測增殖標記(ji)物Mki67在(zai)其(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)不(bu)同(tong)肝(gan)細(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)的比例：在(zai)整(zheng)個再(zai)生過程(cheng)中(zhong)(zhong)(zhong)，距離受損(sun)(sun)組織區域(yu)很遠(yuan)的小葉(xie)中(zhong)(zhong)(zhong)部(bu)和門靜脈(mo)區的肝(gan)細(xi)(xi)胞(bao)呈Mki67陽性（圖2I2J）。不(bu)同(tong)小葉(xie)區增殖和非(fei)增殖肝(gan)細(xi)(xi)胞(bao)之間的差異(yi)表(biao)達分(fen)析(xi)表(biao)明，增殖肝(gan)細(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)的肝(gan)細(xi)(xi)胞(bao)代謝(xie)功能降低。肝(gan)細(xi)(xi)胞(bao)在(zai)整(zheng)個小葉(xie)軸的廣(guang)泛增殖可(ke)能有助(zhu)于(yu)產生有絲分(fen)裂壓(ya)力，從而快速替換受損(sun)(sun)區域(yu)的細(xi)(xi)胞(bao)，這(zhe)種有絲分(fen)裂壓(ya)力將小葉(xie)中(zhong)(zhong)(zhong)部(bu)肝(gan)細(xi)(xi)胞(bao)帶(dai)入中(zhong)(zhong)(zhong)心周圍區，需要對其(qi)轉錄狀(zhuang)態進行重編程(cheng)。

Figure 2. 重建肝細胞再生過程基因空間帶狀表達圖譜

Figure S2. 空間轉錄組數據集分析

三、界面肝細胞基因表達模式及形態特征

為了進一(yi)步研(yan)究有絲(si)分(fen)裂壓力(li)如(ru)何將(jiang)小葉中肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)通(tong)過重(zhong)編(bian)程帶入中心(xin)區，本研(yan)究繼(ji)續對注(zhu)射APAP后48h和72h的(de)(de)中心(xin)周圍(wei)(wei)肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)及(ji)對應區域的(de)(de)對照組肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)轉(zhuan)錄本做差異(yi)分(fen)析，這(zhe)些肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)存在于損傷與(yu)未(wei)損傷界(jie)(jie)面(mian)(mian)處，因(yin)此(ci)命名為“界(jie)(jie)面(mian)(mian)肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)”，發(fa)現這(zhe)些細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)具(ju)有明(ming)顯的(de)(de)基因(yin)表(biao)達(da)特(te)(te)征，包括胚胎期(qi)肝(gan)(gan)(gan)(gan)臟和肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)癌(ai)中高表(biao)達(da)但在成人肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中不(bu)表(biao)達(da)的(de)(de)基因(yin)，例(li)如(ru)Afp（編(bian)碼胎兒(er)血清蛋白(bai)(bai)的(de)(de)甲(jia)胎蛋白(bai)(bai)），Spp1（編(bian)碼骨橋蛋白(bai)(bai)），Cdh17（肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)癌(ai)中編(bian)碼與(yu)Wnt信號激活相關(guan)的(de)(de)鈣(gai)粘素蛋白(bai)(bai)）（圖(tu)(tu)(tu)3A3B），并使(shi)用smFISH來(lai)驗證這(zhe)些基因(yin)的(de)(de)特(te)(te)異(yi)性(xing)表(biao)達(da)（圖(tu)(tu)(tu)3C3D）。通(tong)過GSEA分(fen)析發(fa)現界(jie)(jie)面(mian)(mian)肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)上調包括核糖體和蛋白(bai)(bai)酶體在內的(de)(de)通(tong)路（圖(tu)(tu)(tu)3E）。此(ci)外還發(fa)現界(jie)(jie)面(mian)(mian)肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)呈間充質樣(yang)形狀，細(xi)(xi)(xi)長的(de)(de)突起延伸到損傷區，與(yu)非界(jie)(jie)面(mian)(mian)肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)相比，圓形度較低（圖(tu)(tu)(tu)3F3G）。這(zhe)些結果表(biao)明(ming)，界(jie)(jie)面(mian)(mian)肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)不(bu)會簡單地(di)從門靜脈周圍(wei)(wei)/小葉中狀態(tai)(tai)轉(zhuan)變為中央(yang)周圍(wei)(wei)狀態(tai)(tai)，因(yin)為它們(men)被推入中央(yang)周圍(wei)(wei)區域。相反，其(qi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)特(te)(te)性(xing)的(de)(de)變化與(yu)胚胎期(qi)基因(yin)的(de)(de)瞬時表(biao)達(da)、蛋白(bai)(bai)質翻譯(yi)和降解的(de)(de)升高以及(ji)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)形態(tai)(tai)的(de)(de)改(gai)變有關(guan)。

Figure 3.界面肝細胞基因表達模式及形態特征

四、肝星狀細胞（HSC）的空間分工模式

完善的(de)(de)(de)(de)組織再(zai)(zai)生(sheng)往(wang)往(wang)需要組織內部細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)間(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)高度協作。肝(gan)(gan)星(xing)狀細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（HSC）在肝(gan)(gan)臟(zang)損(sun)(sun)(sun)傷(shang)(shang)再(zai)(zai)生(sheng)過(guo)程(cheng)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)也起(qi)非常關鍵的(de)(de)(de)(de)作用。本研究聯合前人已發表的(de)(de)(de)(de)單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)數(shu)據(ju)集(ji)進一(yi)步重(zhong)建了HSC沿(yan)肝(gan)(gan)小葉(xie)軸的(de)(de)(de)(de)空間(jian)(jian)帶(dai)狀分(fen)布模(mo)(mo)(mo)式(shi)(shi)（圖(tu)4A），發現HSC具有(you)明顯的(de)(de)(de)(de)空間(jian)(jian)分(fen)工模(mo)(mo)(mo)式(shi)(shi)：中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)心周(zhou)(zhou)圍(wei)區（pericentral）、小葉(xie)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)區（midlobular）和(he)(he)門(men)靜脈周(zhou)(zhou)圍(wei)區（periportal zones）(圖(tu)4B)。通過(guo)與(yu)(yu)空間(jian)(jian)轉錄組數(shu)據(ju)集(ji)比較，驗證了HSC基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)時(shi)空動力學（圖(tu)S2I）。肝(gan)(gan)星(xing)狀細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)靜止基(ji)(ji)因(yin)如(ru)視黃醇結合蛋(dan)白(bai)(bai)（Rbp1）和(he)(he)卵磷脂(zhi)視黃醇酰基(ji)(ji)轉移(yi)(yi)酶（Lrat）的(de)(de)(de)(de)表達(da)(da)水(shui)平(ping)在所有(you)區域(yu)都下降，并(bing)(bing)在96小時(shi)后恢復到(dao)對(dui)照水(shui)平(ping)（圖(tu)4C）。相(xiang)反，參與(yu)(yu)肝(gan)(gan)星(xing)狀細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)激(ji)(ji)活的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)，如(ru)平(ping)滑肌(ji)肌(ji)動蛋(dan)白(bai)(bai)基(ji)(ji)因(yin)（Acta2），在20h達(da)(da)到(dao)表達(da)(da)高峰，主要在中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)央周(zhou)(zhou)圍(wei)區的(de)(de)(de)(de)肝(gan)(gan)星(xing)狀細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)表達(da)(da)（圖(tu)4D）。在APAP誘導的(de)(de)(de)(de)損(sun)(sun)(sun)傷(shang)(shang)和(he)(he)再(zai)(zai)生(sheng)過(guo)程(cheng)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)外基(ji)(ji)質基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)表達(da)(da)在48h以空間(jian)(jian)依賴的(de)(de)(de)(de)方(fang)式(shi)(shi)發生(sheng)了實(shi)質性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)變化，最顯著的(de)(de)(de)(de)是在中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)心周(zhou)(zhou)圍(wei)的(de)(de)(de)(de)HSCs，與(yu)(yu)受損(sun)(sun)(sun)區域(yu)所需的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)質積(ji)聚行(xing)為相(xiang)一(yi)致（圖(tu)4E）。肝(gan)(gan)星(xing)狀細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)增(zeng)殖基(ji)(ji)因(yin)在48h達(da)(da)到(dao)高峰，且門(men)靜脈周(zhou)(zhou)圍(wei)區和(he)(he)小葉(xie)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)區比中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)央周(zhou)(zhou)圍(wei)區有(you)更(geng)高的(de)(de)(de)(de)表達(da)(da)（圖(tu)4F）。綜上，可以推出中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)央周(zhou)(zhou)圍(wei)的(de)(de)(de)(de)HSC快(kuai)速響應(ying)APAP誘導的(de)(de)(de)(de)損(sun)(sun)(sun)傷(shang)(shang)，激(ji)(ji)活并(bing)(bing)產生(sheng)ECM，并(bing)(bing)與(yu)(yu)免疫(yi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)相(xiang)互(hu)作用，而門(men)靜脈周(zhou)(zhou)圍(wei)的(de)(de)(de)(de)HSC優先增(zeng)殖，生(sheng)成可遷(qian)移(yi)(yi)到(dao)受損(sun)(sun)(sun)區以支持主動再(zai)(zai)生(sheng)過(guo)程(cheng)的(de)(de)(de)(de)備用HSC。大多數(shu)HSC激(ji)(ji)活配體起(qi)源(yuan)于單(dan)核細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)和(he)(he)巨噬細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、內皮(pi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)和(he)(he)HSC本身。本研究發現了區域(yu)特異性(xing)(xing)HSC表達(da)(da)模(mo)(mo)(mo)式(shi)(shi)，這些模(mo)(mo)(mo)式(shi)(shi)可能(neng)促進急性(xing)(xing)APAP損(sun)(sun)(sun)傷(shang)(shang)后肝(gan)(gan)臟(zang)表現出的(de)(de)(de)(de)免疫(yi)招(zhao)募、ECM積(ji)聚和(he)(he)分(fen)解的(de)(de)(de)(de)時(shi)間(jian)(jian)協調過(guo)程(cheng)。

Figure 4. 肝星狀細胞的空間分工模式

五、肝臟內皮細胞在再生過程中出現帶狀分布特征

肝(gan)(gan)(gan)(gan)臟(zang)內(nei)(nei)皮(pi)(pi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)是肝(gan)(gan)(gan)(gan)功(gong)能(neng)的(de)重要(yao)調(diao)節細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，主要(yao)功(gong)能(neng)是清除內(nei)(nei)毒(du)素、細(xi)菌和其他化合物，調(diao)節宿主對病原體的(de)免疫反應以及呈(cheng)遞抗原等。研究(jiu)表明，與肝(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和肝(gan)(gan)(gan)(gan)星(xing)狀細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)相(xiang)似，肝(gan)(gan)(gan)(gan)臟(zang)內(nei)(nei)皮(pi)(pi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)同樣表現(xian)出沿著肝(gan)(gan)(gan)(gan)小葉(xie)軸呈(cheng)現(xian)帶狀分(fen)布(bu)特征。為了進(jin)一步研究(jiu)肝(gan)(gan)(gan)(gan)臟(zang)內(nei)(nei)皮(pi)(pi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)亞群支持肝(gan)(gan)(gan)(gan)臟(zang)再(zai)生的(de)機制(zhi)，本(ben)研究(jiu)將肝(gan)(gan)(gan)(gan)臟(zang)內(nei)(nei)皮(pi)(pi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)分(fen)成(cheng)5個帶狀分(fen)布(bu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)亞群，包括：中(zhong)心區(qu)肝(gan)(gan)(gan)(gan)血管內(nei)(nei)皮(pi)(pi)(PC-LVECs)，中(zhong)心區(qu)、小葉(xie)中(zhong)部和門(men)靜(jing)脈周肝(gan)(gan)(gan)(gan)竇內(nei)(nei)皮(pi)(pi)(PC-LSECs, mid-LSECs, PP-LSECs)，門(men)靜(jing)脈周肝(gan)(gan)(gan)(gan)血管內(nei)(nei)皮(pi)(pi)(PP- LVECs)（圖(tu)5A5B5C）。并進(jin)一步通過(guo)空間(jian)轉錄組(zu)數據集驗(yan)證了肝(gan)(gan)(gan)(gan)臟(zang)內(nei)(nei)皮(pi)(pi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)帶狀空間(jian)分(fen)布(bu)模(mo)式（圖(tu)S2J）。

Figure 5.肝臟內皮細胞在再生過程中出現帶狀分布特征

六、髓系免疫細胞亞型在再生過程中的動態變化

髓系細(xi)(xi)胞(bao)同樣(yang)在(zai)(zai)急性(xing)肝損傷(shang)后的(de)(de)(de)再生(sheng)過(guo)(guo)程(cheng)中發揮著重要作用(yong)。本研究(jiu)鑒定了10種不(bu)(bu)同的(de)(de)(de)髓系免疫細(xi)(xi)胞(bao)類型，其中單(dan)核(he)(he)細(xi)(xi)胞(bao)比例在(zai)(zai)24小時(shi)達到(dao)峰(feng)值，而(er)巨噬細(xi)(xi)胞(bao)在(zai)(zai)48小時(shi)達到(dao)峰(feng)值，提示該巨噬細(xi)(xi)胞(bao)分化來(lai)源于單(dan)核(he)(he)細(xi)(xi)胞(bao)。Kupffer細(xi)(xi)胞(bao)和單(dan)核(he)(he)細(xi)(xi)胞(bao)在(zai)(zai)所(suo)有時(shi)間點都形成不(bu)(bu)同的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)亞群，表明(ming)急性(xing)肝損傷(shang)過(guo)(guo)程(cheng)死(si)亡的(de)(de)(de)Kupffer細(xi)(xi)胞(bao)是通過(guo)(guo)存活的(de)(de)(de)Kupffer細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)增(zeng)殖而(er)被替代，而(er)不(bu)(bu)是來(lai)源于單(dan)核(he)(he)細(xi)(xi)胞(bao)（圖6A6B6C）。

在激(ji)活的(de)Kupffer細(xi)胞(bao)(bao)中上(shang)調最(zui)多的(de)基(ji)(ji)因是Mmp12（編碼彈性蛋(dan)白酶(mei)基(ji)(ji)質(zhi)金屬肽酶(mei)12的(de)基(ji)(ji)因），Mmp12在24小時(shi)的(de)表達(da)水平是對(dui)照(zhao)組的(de)637倍，值得注(zhu)意的(de)是，Mmp12在巨噬細(xi)胞(bao)(bao)中也表現出上(shang)調的(de)情況(kuang)（圖6D）。當使用smFISH對(dui)MMP12的(de)表達(da)進(jin)行成像時(shi)，發(fa)現它在位于損傷(shang)區域的(de)髓系細(xi)胞(bao)(bao)中表達(da)（圖6E）。

Figure 6. 髓系免疫細胞亞型在再生過程中的動態變化

肝(gan)臟組織(zhi)再(zai)生(sheng)可通過(guo)多(duo)種細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型精準的(de)(de)協(xie)調來實現。本(ben)研究(jiu)利(li)用單(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)分(fen)析手段研究(jiu)了小鼠(shu)肝(gan)臟急性損傷(shang)后(hou)再(zai)生(sheng)過(guo)程(cheng)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)時空(kong)動態調控過(guo)程(cheng)。發(fa)現肝(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)在(zai)(zai)肝(gan)小葉內增殖(zhi)，產生(sheng)有(you)絲分(fen)裂(lie)壓力(li)，使壞死(si)的(de)(de)中(zhong)心區(qu)迅速再(zai)生(sheng)。位于再(zai)生(sheng)界面的(de)(de)部(bu)分(fen)肝(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)會在(zai)(zai)重(zhong)新(xin)編(bian)程(cheng)到(dao)中(zhong)心周圍狀態過(guo)程(cheng)中(zhong)，短暫(zan)上(shang)調胚胎特異性基(ji)因(yin)。而空(kong)間帶(dai)狀分(fen)布的(de)(de)內皮細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、肝(gan)星(xing)狀細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（HSC）和(he)巨噬細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)群體(ti)在(zai)(zai)免(mian)疫募集(ji)、增殖(zhi)和(he)基(ji)質重(zhong)塑中(zhong)存在(zai)(zai)差異。其中(zhong)可觀察到(dao)大量的(de)(de)暫(zan)時性骨髓細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)浸(jin)潤，但淋巴細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)豐度(du)與抗原呈(cheng)遞能(neng)力(li)整體(ti)都(dou)呈(cheng)現下降趨勢(shi)。本(ben)研究(jiu)促進了人類(lei)理解肝(gan)再(zai)生(sheng)過(guo)程(cheng)的(de)(de)區(qu)域性協(xie)調過(guo)程(cheng)（圖(tu)7）。

Figure 7. APAP誘導的肝損傷和再生過程總結