通(tong)過(guo)對亞(ya)硝酸(suan)鹽和(he)(he)(he)2’-脫(tuo)氧腺(xian)苷(gan)(gan)和(he)(he)(he)2’-脫(tuo)氧胞(bao)(bao)苷(gan)(gan)的(de)反應產物進行HPLC分(fen)(fen)離和(he)(he)(he)質譜分(fen)(fen)析(xi)，結果表明了(le)在(zai)(zai)(zai)亞(ya)硝酸(suan)鹽處(chu)理(li)條(tiao)件下，腺(xian)嘌(piao)呤、胞(bao)(bao)嘧(mi)(mi)(mi)啶和(he)(he)(he)5mC脫(tuo)氨，分(fen)(fen)別(bie)產生肌(ji)苷(gan)(gan)(I)、尿(niao)嘧(mi)(mi)(mi)啶(U)、胸腺(xian)嘧(mi)(mi)(mi)啶(T)，在(zai)(zai)(zai)PCR擴(kuo)增時(shi)聚(ju)合酶會將肌(ji)苷(gan)(gan)(I)讀(du)作鳥嘌(piao)呤(G)，尿(niao)嘧(mi)(mi)(mi)啶(U)讀(du)作胸腺(xian)嘧(mi)(mi)(mi)啶(T)，堿基發(fa)生改(gai)變，此(ci)外5mC在(zai)(zai)(zai)亞(ya)硝酸(suan)鹽處(chu)理(li)中的(de)脫(tuo)氨率比胞(bao)(bao)嘧(mi)(mi)(mi)啶高(gao)4.5倍，可(ke)借此(ci)區分(fen)(fen)胞(bao)(bao)嘧(mi)(mi)(mi)啶和(he)(he)(he)5mC；而6mA和(he)(he)(he)4mC脫(tuo)氨基會產生亞(ya)硝基化(hua)6mA(6mA-NO)和(he)(he)(he)亞(ya)硝基化(hua)4mC(4mC-NO)，在(zai)(zai)(zai)PCR擴(kuo)增時(shi)聚(ju)合酶會將6mA-NO和(he)(he)(he)4mC-NO分(fen)(fen)別(bie)讀(du)作腺(xian)嘌(piao)呤(A)和(he)(he)(he)胞(bao)(bao)嘧(mi)(mi)(mi)啶(C)，堿基未(wei)發(fa)生改(gai)變，如(ru)圖1-a所示。

在此(ci)基(ji)(ji)礎上設計了(le)(le)(le)(le)(le)一(yi)(yi)個實(shi)驗流(liu)(liu)程來(lai)驗證亞硝酸(suan)鹽(yan)處(chu)(chu)理可用于(yu)開發一(yi)(yi)種可以同時(shi)檢測全基(ji)(ji)因(yin)組三(san)種類型(xing)的甲基(ji)(ji)化的測序方法。首先雜交了(le)(le)(le)(le)(le)兩種保護(hu)性寡(gua)核苷酸(suan)，它們(men)與單鏈(lian)DNA的引物區域反(fan)向互補，以此(ci)保護(hu)堿(jian)(jian)(jian)基(ji)(ji)免于(yu)脫(tuo)氨，而未保護(hu)的序列中(zhong)的堿(jian)(jian)(jian)基(ji)(ji)在亞硝酸(suan)鹽(yan)處(chu)(chu)理下，腺嘌呤(ling)、胞嘧啶和(he)5mC堿(jian)(jian)(jian)基(ji)(ji)會發生變化，而6mA和(he)4mC堿(jian)(jian)(jian)基(ji)(ji)不(bu)會發生改變，如圖1-b所(suo)示(shi)。并在此(ci)實(shi)驗過程中(zhong)確定(ding)了(le)(le)(le)(le)(le)2.3%乙酸(suan)、1M亞硝酸(suan)鈉(na)(pH=4.187)，并在37℃下孵(fu)育為最佳處(chu)(chu)理條件以達到(dao)最高的脫(tuo)氨效率。同時(shi)為了(le)(le)(le)(le)(le)對(dui)基(ji)(ji)因(yin)組DNA進行甲基(ji)(ji)化分析，需(xu)要將NT-seq讀(du)數與參(can)考基(ji)(ji)因(yin)組對(dui)齊，因(yin)此(ci)開發了(le)(le)(le)(le)(le)一(yi)(yi)個NT-seq分析流(liu)(liu)程，該分析管道可以容忍亞硝酸(suan)鹽(yan)處(chu)(chu)理引入的所(suo)有可能的堿(jian)(jian)(jian)基(ji)(ji)變化(A到(dao)G、C到(dao)T或G到(dao)A)，如圖2-a所(suo)示(shi)。 

圖1 NT-seq實(shi)驗原理圖

圖2 Nt-seq分析流程

使用NT-seq檢測寡核苷酸中的6mA、4mC和5mC

采(cai)用2021年發表(biao)(biao)的(de)(de)(de)亞硝酸(suan)鹽介導的(de)(de)(de)DNA測序方法對修飾的(de)(de)(de)6mA、4mC和5mC和未(wei)修飾的(de)(de)(de)寡(gua)核苷酸(suan)進行了初步試驗。發現6mA位(wei)置(zhi)，A與(yu)G比(bi)(bi)(bi)率約為18倍低于(yu)其他(ta)腺(xian)嘌(piao)呤位(wei)置(zhi)，并(bing)且(qie)發現6mA位(wei)置(zhi)歸(gui)一(yi)(yi)化(hua)的(de)(de)(de)A到G頻率與(yu)6mA百分比(bi)(bi)(bi)線(xian)性相關，表(biao)(biao)明(ming)NT-seq可(ke)以精確量化(hua)6mA頻率。而4mC和5mC的(de)(de)(de)分析結果與(yu)6mA類(lei)(lei)似，除(chu)了5mC位(wei)置(zhi)的(de)(de)(de)C到T比(bi)(bi)(bi)率比(bi)(bi)(bi)其他(ta)胞嘧啶(ding)位(wei)置(zhi)高約40%，這與(yu)先(xian)前(qian)的(de)(de)(de)研究一(yi)(yi)致，表(biao)(biao)明(ming)5mC比(bi)(bi)(bi)C更容易脫氨基，如圖(tu)3所(suo)(suo)示。證明(ming)了NT-seq可(ke)以檢測DNA寡(gua)核苷酸(suan)中所(suo)(suo)有三種類(lei)(lei)型的(de)(de)(de)DNA甲基化(hua)。

圖3 NT-seq檢測寡核苷酸中的腺嘌呤和胞嘧啶甲基化

以(yi)大腸桿菌MG1655基(ji)因(yin)組(zu)為實(shi)(shi)驗(yan)材料，來驗(yan)證(zheng)NT-seq檢(jian)測基(ji)因(yin)組(zu)DNA中三(san)種甲基(ji)化基(ji)序(xu)(xu)(xu)的(de)(de)(de)(de)能力。實(shi)(shi)驗(yan)結果(guo)顯示(shi)，與(yu)(yu)未甲基(ji)化的(de)(de)(de)(de)腺(xian)嘌呤(ling)位點相比(bi)(bi)，已知6mA位點(Dam和M.EcoKI基(ji)序(xu)(xu)(xu))的(de)(de)(de)(de)A到(dao)(dao)G頻率顯著降低，而(er)以(yi)M.EcoKII基(ji)序(xu)(xu)(xu)為陰性(xing)對照(甲基(ji)轉(zhuan)移(yi)酶M.EcoKII在實(shi)(shi)驗(yan)室條(tiao)件(jian)下不表(biao)達)，結果(guo)顯示(shi)M.EcoKII基(ji)序(xu)(xu)(xu)的(de)(de)(de)(de)A到(dao)(dao)G比(bi)(bi)率與(yu)(yu)未甲基(ji)化的(de)(de)(de)(de)腺(xian)嘌呤(ling)位點沒有區別，以(yi)上(shang)結果(guo)表(biao)明NT-seq檢(jian)測的(de)(de)(de)(de)是真正的(de)(de)(de)(de)6mA基(ji)序(xu)(xu)(xu)。為了(le)進(jin)一(yi)步驗(yan)證(zheng)該結果(guo)，采用(yong)基(ji)因(yin)敲(qiao)除技術獲得hsdM KO(M.EcoKI)和dam/dcm突(tu)變菌株(zhu)進(jin)行實(shi)(shi)驗(yan)，發現(xian)與(yu)(yu)野生型大腸桿菌菌株(zhu)相比(bi)(bi)，hsdM KO和dam/dcm突(tu)變菌株(zhu)的(de)(de)(de)(de)基(ji)序(xu)(xu)(xu)與(yu)(yu)未甲基(ji)化腺(xian)嘌呤(ling)位點的(de)(de)(de)(de)A到(dao)(dao)G比(bi)(bi)率沒有差(cha)異，再次驗(yan)證(zheng)NT-seq檢(jian)測的(de)(de)(de)(de)是真正的(de)(de)(de)(de)6mA基(ji)序(xu)(xu)(xu)。

接(jie)下來(lai)驗證NT-seq檢(jian)測(ce)的是真正的4mC和5mC基(ji)序。以幽門螺桿菌(jun)JP26基(ji)因(yin)組為實驗材料，采(cai)用(yong)與檢(jian)測(ce)6mA基(ji)序相同的方法(fa)，結果表(biao)明NT-seq確實可用(yong)于同時檢(jian)測(ce)細(xi)菌(jun)基(ji)因(yin)組中多種類(lei)型的DNA甲(jia)基(ji)化基(ji)序。

圖4 NT-seq同時檢測細菌中的三種甲基化基序

在證(zheng)明NT-seq可(ke)以(yi)檢(jian)測細菌(jun)中(zhong)(zhong)已知甲(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)基(ji)(ji)(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)的(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)礎上，作者準(zhun)備驗證(zheng)NT-seq是否可(ke)以(yi)發現新的(de)甲(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)基(ji)(ji)(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)。以(yi)幽門螺桿菌(jun)JP26基(ji)(ji)(ji)(ji)因組(zu)(zu)(zu)為實驗材(cai)料(liao)，收集了(le)所有(you)可(ke)能的(de)甲(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)的(de)腺嘌呤基(ji)(ji)(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)，根據這些基(ji)(ji)(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)的(de)A到G比率分為兩組(zu)(zu)(zu)：上組(zu)(zu)(zu)中(zhong)(zhong)大多數是已知的(de)6mA基(ji)(ji)(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)，下組(zu)(zu)(zu)主要包(bao)含未甲(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)基(ji)(ji)(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)，其中(zhong)(zhong)有(you)少數例外。在對例外情況中(zhong)(zhong)的(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)(GMRG6mA)基(ji)(ji)(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)的(de)一(yi)個子基(ji)(ji)(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)(GAGG6mA)進行分析時發現是由于之前的(de)SMRT-seq工作流程不(bu)精確(que)地(di)將GAAG6mA和GCRG6mA歸(gui)類為GMRG6mA基(ji)(ji)(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)。

此外，NT-seq也(ye)鑒定了一種新(xin)的6mA基(ji)(ji)(ji)序(GGWCN6mA)，并(bing)且該繼續未被SMRT-seq鑒定。在對該基(ji)(ji)(ji)序的亞基(ji)(ji)(ji)序分析時(shi)發(fa)現(xian)其與未甲基(ji)(ji)(ji)化(hua)基(ji)(ji)(ji)序相比(bi)，所有(you)亞基(ji)(ji)(ji)序的A到(dao)G比(bi)率顯著(zhu)降低。在SMRT-seq IPD比(bi)率量化(hua)中(zhong)也(ye)觀(guan)察到(dao)類似趨勢，表明GGWCN6mA是真正的6mA基(ji)(ji)(ji)序。除(chu)此之外也(ye)對幽(you)門(men)螺桿菌JP26中(zhong)的4mC和5mC基(ji)(ji)(ji)序進行了檢測，但未能發(fa)現(xian)新(xin)的基(ji)(ji)(ji)序，這可能是由(you)于該基(ji)(ji)(ji)因組中(zhong)已經沒有(you)新(xin)的其他胞(bao)嘧啶甲基(ji)(ji)(ji)化(hua)基(ji)(ji)(ji)序。

綜合以上(shang)結果，表明NT-seq不僅(jin)可(ke)以驗證報(bao)告的(de)甲基(ji)(ji)化基(ji)(ji)序(xu)(xu)，還可(ke)以識別細(xi)菌基(ji)(ji)因(yin)組(zu)中的(de)新的(de)甲基(ji)(ji)化基(ji)(ji)序(xu)(xu)。

圖5 NT-seq發現新的甲基化基序

以(yi)商(shang)業(ye)微生(sheng)物(wu)(wu)群(qun)(qun)落(luo)標(biao)準品為實(shi)驗材料，來確定NT-seq是(shi)否可以(yi)檢測微生(sheng)物(wu)(wu)群(qun)(qun)落(luo)中(zhong)(zhong)的(de)(de)DNA甲(jia)基(ji)化(hua)(hua)。該商(shang)業(ye)微生(sheng)物(wu)(wu)群(qun)(qun)落(luo)中(zhong)(zhong)包括八(ba)種(zhong)細菌(jun)(jun)和兩種(zhong)真(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)，由于兩種(zhong)真(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)沒(mei)有(you)(you)報道(dao)的(de)(de)甲(jia)基(ji)化(hua)(hua)基(ji)序(xu)(xu)(xu)，因(yin)此將6mA分(fen)(fen)析集(ji)中(zhong)(zhong)在(zai)(zai)八(ba)種(zhong)細菌(jun)(jun)上，而(er)這八(ba)種(zhong)細菌(jun)(jun)分(fen)(fen)別為枯草芽胞(bao)桿(gan)菌(jun)(jun)、大腸(chang)(chang)(chang)桿(gan)菌(jun)(jun)、糞(fen)(fen)腸(chang)(chang)(chang)球菌(jun)(jun)、單核(he)細胞(bao)李斯特菌(jun)(jun)、金黃色葡萄(tao)球菌(jun)(jun)、腸(chang)(chang)(chang)桿(gan)菌(jun)(jun)和發酵(jiao)乳桿(gan)菌(jun)(jun)。收集(ji)了所(suo)有(you)(you)可能的(de)(de)甲(jia)基(ji)化(hua)(hua)腺嘌呤(ling)基(ji)序(xu)(xu)(xu)，發現(xian)了在(zai)(zai)7種(zhong)細菌(jun)(jun)菌(jun)(jun)株中(zhong)(zhong)，發現(xian)之前SMRT-seq數據與NT-seq數據結果(guo)有(you)(you)所(suo)差異，例如糞(fen)(fen)腸(chang)(chang)(chang)球菌(jun)(jun)和發酵(jiao)乳桿(gan)菌(jun)(jun)，其(qi)中(zhong)(zhong)糞(fen)(fen)腸(chang)(chang)(chang)球菌(jun)(jun)在(zai)(zai)SMRT-seq分(fen)(fen)析中(zhong)(zhong)具有(you)(you)微小差異的(de)(de)兩個6mA基(ji)序(xu)(xu)(xu)，而(er)在(zai)(zai)NT-seq檢測中(zhong)(zhong)卻(que)沒(mei)有(you)(you)差異，因(yin)此證(zheng)明(ming)這兩個基(ji)序(xu)(xu)(xu)不(bu)一(yi)定是(shi)甲(jia)基(ji)化(hua)(hua)6mA；在(zai)(zai)發酵(jiao)乳桿(gan)菌(jun)(jun)中(zhong)(zhong)，SMRT-seq檢測中(zhong)(zhong)沒(mei)有(you)(you)可用(yong)數據，而(er)在(zai)(zai)NT-seq檢測中(zhong)(zhong)發現(xian)AG6mAGG基(ji)序(xu)(xu)(xu)與未(wei)修飾的(de)(de)6mA基(ji)序(xu)(xu)(xu)相(xiang)比(bi)，A與G比(bi)率有(you)(you)所(suo)降低，且降低程度相(xiang)似，同(tong)時(shi)AG6mAGG的(de)(de)大多數亞(ya)基(ji)序(xu)(xu)(xu)A到G比(bi)率分(fen)(fen)布顯(xian)示出與未(wei)甲(jia)基(ji)化(hua)(hua)基(ji)序(xu)(xu)(xu)的(de)(de)明(ming)顯(xian)分(fen)(fen)離(li)，表(biao)明(ming)其(qi)是(shi)真(zhen)(zhen)(zhen)的(de)(de)6mA基(ji)序(xu)(xu)(xu)。并且在(zai)(zai)對總(zong)6mA基(ji)序(xu)(xu)(xu)豐度分(fen)(fen)析中(zhong)(zhong)發現(xian)AG6mAGG基(ji)序(xu)(xu)(xu)占75%，是(shi)最(zui)顯(xian)著富集(ji)的(de)(de)基(ji)序(xu)(xu)(xu)，綜上結果(guo)證(zheng)明(ming)NT-seq檢測到的(de)(de)AG6mAGG確實(shi)是(shi)發酵(jiao)乳桿(gan)菌(jun)(jun)基(ji)因(yin)組中(zhong)(zhong)真(zhen)(zhen)(zhen)正的(de)(de)6mA基(ji)序(xu)(xu)(xu)。

在(zai)(zai)NT-seq可以(yi)檢(jian)測(ce)到(dao)微(wei)生(sheng)物(wu)群(qun)落參考(kao)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)6mA的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)礎上，驗證是(shi)(shi)否可以(yi)檢(jian)測(ce)到(dao)4mC和5mC，但(dan)是(shi)(shi)在(zai)(zai)這(zhe)些(xie)細菌(jun)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)組中(zhong)(zhong)沒有(you)檢(jian)測(ce)到(dao)4mC，可能是(shi)(shi)由(you)于(yu)這(zhe)些(xie)細菌(jun)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)組中(zhong)(zhong)沒有(you)4mC基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)序；而(er)對于(yu)5mC的(de)(de)(de)話，在(zai)(zai)對8種(zhong)細菌(jun)的(de)(de)(de)亞硫(liu)酸氫鹽測(ce)序數據分析中(zhong)(zhong)在(zai)(zai)枯草、大腸、金黃色(se)葡萄球菌(jun)和腸桿(gan)菌(jun)中(zhong)(zhong)鑒定出6個胞(bao)嘧(mi)啶(ding)甲(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)(hua)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)序，而(er)在(zai)(zai)NT-seq的(de)(de)(de)測(ce)序中(zhong)(zhong)這(zhe)些(xie)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)序的(de)(de)(de)C與T比率(lv)均高(gao)于(yu)未甲(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)(hua)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)序的(de)(de)(de)比率(lv)，這(zhe)表(biao)明這(zhe)些(xie)胞(bao)嘧(mi)啶(ding)甲(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)(hua)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)序是(shi)(shi)5mC甲(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)(hua)而(er)不(bu)是(shi)(shi)4mC甲(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)(hua)，因(yin)為5mC的(de)(de)(de)脫氨率(lv)比未甲(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)(hua)胞(bao)嘧(mi)啶(ding)要高(gao)4.5倍。因(yin)此(ci)以(yi)上結果可以(yi)表(biao)明NT-seq可以(yi)檢(jian)測(ce)微(wei)生(sheng)物(wu)群(qun)落中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)甲(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)(hua)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)序。 

圖6 微生物群落參考中的甲基化基序檢測

DIP-NT-seq可以單堿基分辨率分析6mA

為(wei)了(le)(le)(le)評估NT-seq在(zai)單(dan)堿基(ji)(ji)分辨率(lv)(lv)下檢(jian)(jian)測(ce)(ce)不同(tong)類(lei)型(xing)DNA甲基(ji)(ji)化性(xing)能，作者以(yi)(yi)幽門(men)螺桿(gan)菌基(ji)(ji)因(yin)組中的(de)(de)每種(zhong)甲基(ji)(ji)化類(lei)型(xing)生成了(le)(le)(le)ROC曲線。與(yu)寡核苷酸結(jie)果一(yi)致，NT-seq在(zai)單(dan)堿基(ji)(ji)分辨率(lv)(lv)下檢(jian)(jian)測(ce)(ce)6mA和4mC的(de)(de)性(xing)能相似(si)，5mC檢(jian)(jian)測(ce)(ce)的(de)(de)性(xing)能顯(xian)著(zhu)下降(jiang)。為(wei)了(le)(le)(le)探(tan)索NT-seq在(zai)單(dan)堿基(ji)(ji)分辨率(lv)(lv)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)甲基(ji)(ji)化的(de)(de)性(xing)能是否可(ke)以(yi)(yi)進(jin)一(yi)步提高，將6mA-DIP與(yu)NT-seq結(jie)合并在(zai)大腸(chang)桿(gan)菌基(ji)(ji)因(yin)組中進(jin)行(xing)了(le)(le)(le)測(ce)(ce)試，同(tong)時(shi)為(wei)了(le)(le)(le)全(quan)面(mian)評估NT-seq在(zai)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)6mA位(wei)(wei)點(dian)(dian)的(de)(de)性(xing)能，使(shi)用Dam/M.EcoKI基(ji)(ji)序(xu)作為(wei)6mA位(wei)(wei)點(dian)(dian)的(de)(de)標準，生成了(le)(le)(le)未富集(ji)和 DIP 富集(ji)樣品(pin)的(de)(de) ROC 曲線。一(yi)致地，DIP 富集(ji)極(ji)大地提高了(le)(le)(le)不同(tong)測(ce)(ce)序(xu)深度閾值(zhi)下的(de)(de) AUC 分數。

為(wei)了進一(yi)步驗證(zheng)DIP-NT-seq的(de)(de)(de)(de)性(xing)能，將(jiang)DIP-seq與成熟的(de)(de)(de)(de)SMRT-seq方法(fa)(fa)在6mA單堿(jian)基檢(jian)測上(shang)進行(xing)比(bi)較(jiao)，我(wo)們發現DIP-NT-seq和SMRT-seq結果是一(yi)致(zhi)的(de)(de)(de)(de)。此外(wai)，使(shi)用(yong)Dam/M.EcoKI介(jie)導的(de)(de)(de)(de)6mA作(zuo)為(wei)實(shi)驗對象，DIP-NT-seq可(ke)以(yi)檢(jian)測到SMRT-seq中高(gao)(gao)達76.8%的(de)(de)(de)(de)假陰性(xing)位點，而SMRT-seq中僅檢(jian)測到0.3%的(de)(de)(de)(de)假陽性(xing)位點，表(biao)明DIP-NT-seq能夠有(you)效過濾從SMRT-seq中識(shi)別出的(de)(de)(de)(de)假陽性(xing)6mA。除了SMRT-seq，我(wo)們還將(jiang)DIP-NT-seq與其(qi)他一(yi)些基于高(gao)(gao)通(tong)量(liang)測序(xu)的(de)(de)(de)(de)大腸桿菌6mA 檢(jian)測方法(fa)(fa)進行(xing)了比(bi)較(jiao)，例如6mA DIP-seq和6mACE-seq。比(bi)較(jiao)結果顯示DIP-NT-seq 不(bu)僅可(ke)以(yi)將(jiang)傳統的(de)(de)(de)(de) DIP-seq 提(ti)高(gao)(gao)到單堿(jian)基分辨率(lv)，還可(ke)以(yi)提(ti)高(gao)(gao) 6mA 檢(jian)測的(de)(de)(de)(de)靈敏度。

為了確定 NT-seq 是否可以(yi)提高 DIP-seq 的(de)(de)(de)特(te)異性和分(fen)(fen)辨(bian)率，我們在(zai)野(ye)生型和MTA1突變(bian)(bian)的(de)(de)(de)偽尖毛蟲中(zhong)(zhong)進行了DIP-NT-seq。與6mA DIP-seq和SMRT-seq 結果一致，MTA1 突變(bian)(bian)體中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de) 6mA 水平比(bi)野(ye)生型偽尖毛蟲低(di)約(yue) 50%，表明 DIP-NT-seq 可以(yi)穩健(jian)地(di)檢(jian)(jian)測(ce) 6mA 變(bian)(bian)化在(zai)真(zhen)核基因組中(zhong)(zhong)以(yi)單堿基分(fen)(fen)辨(bian)率。DIP-NT-seq 檢(jian)(jian)測(ce)到(dao)的(de)(de)(de) 6mA 的(de)(de)(de) SMRT-seq IPD 比(bi)率顯著高于 DIP-NT-seq 未檢(jian)(jian)測(ce)到(dao)的(de)(de)(de) 6mA，表明 DIP-NT-seq 檢(jian)(jian)測(ce)到(dao)的(de)(de)(de) 6mA 位點可以(yi)在(zai) SMRT-seq 中(zhong)(zhong)交(jiao)叉(cha)驗證。

NT-seq可(ke)用(yong)于(yu)同時檢(jian)測(ce)基因組中(zhong)(zhong)(zhong)所有三種主要(yao)類型的(de)甲(jia)基化基序(xu)(xu)，并且NT-seq不僅可(ke)以檢(jian)測(ce)已知的(de)甲(jia)基化基序(xu)(xu)，還可(ke)以發(fa)(fa)現(xian)新的(de)基序(xu)(xu)。并在此基礎(chu)上(shang)證明(ming)NT-seq可(ke)用(yong)于(yu)在單個細菌物種和(he)微生物群(qun)落(luo)中(zhong)(zhong)(zhong)從頭發(fa)(fa)現(xian)甲(jia)基化基序(xu)(xu)。此外，實驗結(jie)果表明(ming)耦(ou)聯甲(jia)基DNA免疫沉(chen)淀(DIP)和(he)NT-seq可(ke)以在原(yuan)核生物和(he)真核生物中(zhong)(zhong)(zhong)以單堿基分辨率(lv)分析6mA，并且在大腸(chang)桿菌中(zhong)(zhong)(zhong)，DIP-NT-seq與SMRT-seq檢(jian)測(ce)性能相(xiang)當，另(ling)外DIP-NT-seq可(ke)以從DIP-seq或SMRT-seq測(ce)序(xu)(xu)中(zhong)(zhong)(zhong)過濾掉假(jia)陽性的(de)6mA位點，提(ti)高了6mA檢(jian)測(ce)的(de)準確(que)性。

除了以(yi)上這(zhe)些優點之外，NT-seq還有一些限(xian)制。首先，目前NT-seq中的(de)(de)亞(ya)硝(xiao)(xiao)酸(suan)鹽處理會導致DNA損傷，這(zhe)給文庫(ku)生成帶(dai)來了麻(ma)煩(fan)，使我們(men)無法將A和(he)C完全(quan)(quan)脫氨(an)以(yi)達到更好的(de)(de)性能。其次，NT-seq讀數偏向于(yu)G-poor區域，這(zhe)可能會限(xian)制NT-seq在富含GC的(de)(de)細菌(jun)基因組(zu)中的(de)(de)應用。最后，NT-seq的(de)(de)5mC檢測效率低于(yu)亞(ya)硫酸(suan)氫鹽測序。這(zhe)些限(xian)制條件(jian)可以(yi)通過尋找(zhao)溫和(he)的(de)(de)亞(ya)硝(xiao)(xiao)酸(suan)鹽處理條件(jian)來克服，以(yi)實現(xian)接近完全(quan)(quan)的(de)(de)脫氨(an)率，同時減少DNA降(jiang)解。

綜上所述，吳濤教授實驗團隊開發了一種NT-seq方法，可以同時檢測原核基因組中所有三種主要類型的DNA甲基化。可以準確檢測單個物種和微生物群落樣本中的甲基化基序。與SMRT-seq相比，NT-seq為細菌甲基化作圖提供了一種經濟高效的解決方案，這將促進細菌表觀遺傳學的研究。通過耦聯甲基 DNA 免疫沉淀 (DIP)，我們發現 NT-seq 可以在細菌基因組中以單堿基分辨率準確分析 6mA，這也可以應用于真核基因組，以幫助消除 6mA DIP-seq 中的非特異性信號。NT-Seq 可以交叉驗證 SMRT-Seq 結果并生成更多訓練(lian)數據(ju)集，用于開發用于甲(jia)基(ji)化分析的機(ji)器學(xue)習工具(ju)。