空間轉錄組分析可以揭示組織結構和環境依賴性細胞-細胞或細胞-環境相互作用的分子景觀。受限于當前的技術手段，獲取單細胞分辨率的全基因組空間轉錄組信息仍具有挑戰性。在這里，我們介紹了一篇Science Advances上發表的方法文章，文章開發了iSpatial這一新算法，通過整合空間轉錄組和單細胞轉錄組信息，推導整個轉錄組的空間模式。

iSpatial算法(fa)(fa)(fa)通過(guo)(guo)整合空間(jian)轉(zhuan)錄組(zu)(zu)和(he)(he)單(dan)(dan)細(xi)胞轉(zhuan)錄組(zu)(zu)信息(xi)，推導整個(ge)轉(zhuan)錄組(zu)(zu)的空間(jian)模式(shi)。與現有的其它(ta)方法(fa)(fa)(fa)相(xiang)比，iSpatial在預測基因表(biao)達和(he)(he)空間(jian)分布具有更高的準確性。此外，它(ta)減(jian)少了原始數(shu)據(ju)(ju)中的假(jia)陽性和(he)(he)假(jia)陰性信號。通過(guo)(guo)對多個(ge)空間(jian)轉(zhuan)錄組(zu)(zu)數(shu)據(ju)(ju)集測試iSpatial，證明(ming)了它(ta)對來自不(bu)同組(zu)(zu)織(zhi)和(he)(he)不(bu)同技術的數(shu)據(ju)(ju)的廣(guang)泛適用(yong)性。因此，這項研(yan)究提(ti)供(gong)了一(yi)種以(yi)單(dan)(dan)細(xi)胞分辨率揭示整個(ge)轉(zhuan)錄組(zu)(zu)空間(jian)組(zu)(zu)織(zhi)的計算方法(fa)(fa)(fa)。伴隨(sui)著(zhu)許多高質(zhi)量(liang)數(shu)據(ju)(ju)集的產生，iSpatial為了解(jie)復雜組(zu)(zu)織(zhi)和(he)(he)疾病過(guo)(guo)程的結(jie)構和(he)(he)功能(neng)提(ti)供(gong)了獨特的方法(fa)(fa)(fa)。

FISH和(he)基于原位(wei)測序的(de)ST技術，例如MERFISH、seqFISH、osmFISH以及STARmap，可(ke)(ke)以在(zai)單細(xi)(xi)胞水平同時揭(jie)示基因表(biao)(biao)達和(he)位(wei)置信(xin)(xin)息(xi)(xi)，但(dan)是(shi)預定義的(de)基因靶點有限（圖(tu)1左）。另一方面，scRNA-seq可(ke)(ke)以無偏地(di)分析整個(ge)轉(zhuan)錄(lu)組(zu)，但(dan)是(shi)不提供空間(jian)(jian)信(xin)(xin)息(xi)(xi)（圖(tu)1中）。通(tong)過整合(he)兩種(zhong)方法(fa)的(de)單細(xi)(xi)胞基因表(biao)(biao)達譜(pu)（逐個(ge)細(xi)(xi)胞的(de)基因矩陣），可(ke)(ke)以根據(ju)scRNA-seq數據(ju)推斷出每個(ge)空間(jian)(jian)圖(tu)譜(pu)細(xi)(xi)胞中非(fei)目標基因的(de)缺失(shi)信(xin)(xin)息(xi)(xi)，從而得(de)到圖(tu)譜(pu)細(xi)(xi)胞的(de)全基因組(zu)空間(jian)(jian)表(biao)(biao)達信(xin)(xin)息(xi)(xi)（圖(tu)1右）。

iSpatial是一(yi)(yi)種(zhong)基(ji)于R開發(fa)的(de)(de)工具(ju)，整合(he)了(le)scRNA-seq和(he)ST譜數(shu)據，以高空(kong)間(jian)分辨率推斷每個(ge)基(ji)因(yin)的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)模(mo)式。①首(shou)先對(dui)scRNA-seq和(he)ST數(shu)據分別進行(xing)降維處(chu)理(li)；②進行(xing)表(biao)(biao)達(da)穩定化處(chu)理(li)：根據主(zhu)成分分析（PCA）空(kong)間(jian)中的(de)(de)相鄰(lin)細(xi)胞(bao)的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)水(shui)平，去除潛(qian)在(zai)的(de)(de)噪(zao)音(yin)/背景表(biao)(biao)達(da)；③兩個(ge)數(shu)據集的(de)(de)歸(gui)一(yi)(yi)化處(chu)理(li)，并通過RPCA+Harmony兩輪連續的(de)(de)整合(he)嵌入到一(yi)(yi)個(ge)共同的(de)(de)空(kong)間(jian)；④在(zai)共嵌合(he)的(de)(de)基(ji)礎上，使用加權(quan)的(de)(de)K-鄰(lin)近（KNN）模(mo)型推斷出ST數(shu)據集中每個(ge)細(xi)胞(bao)中的(de)(de)每個(ge)基(ji)因(yin)的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)值；⑤細(xi)胞(bao)的(de)(de)物理(li)空(kong)間(jian)位置由ST數(shu)據確定；⑥形(xing)成一(yi)(yi)個(ge)新的(de)(de)單細(xi)胞(bao)基(ji)因(yin)表(biao)(biao)達(da)譜，同時具(ju)有全(quan)基(ji)因(yin)組(zu)覆(fu)蓋(gai)和(he)單細(xi)胞(bao)空(kong)間(jian)分辨率；⑦新的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)矩陣可用于下(xia)游分析，包(bao)括(kuo)識別空(kong)間(jian)可變(bian)基(ji)因(yin)（SVG），空(kong)間(jian)表(biao)(biao)達(da)譜分析等。

研究團(tuan)隊使(shi)用不(bu)同組(zu)織和(he)技(ji)術產生的多(duo)個ST數(shu)據(ju)集(ji)測試了iSpatial。與(yu)其它(ta)現(xian)有方(fang)法相(xiang)比，iSpatial在預測基因表(biao)達和(he)空間分布方(fang)面具有更高(gao)的準確(que)性(xing)(xing)。此外，它(ta)還減(jian)少了原始數(shu)據(ju)集(ji)中的假(jia)陽性(xing)(xing)和(he)假(jia)陰性(xing)(xing)信號。同時它(ta)對來自不(bu)同組(zu)織和(he)不(bu)同技(ji)術的數(shu)據(ju)集(ji)具有廣(guang)泛(fan)適(shi)用性(xing)(xing)。

1.iSpatial在預測空間表達模式的準確性方(fang)面(mian)優于(yu)現(xian)有工具

測試數(shu)據(ju)(ju)(ju)：從Slide-seq V2生成(cheng)的小鼠海馬體(ti)空轉數(shu)據(ju)(ju)(ju)集(ji)(ji)。隨機抽(chou)取(qu)3000個基因作為(wei)訓練數(shu)據(ju)(ju)(ju)集(ji)(ji)，其他基因作為(wei)驗證數(shu)據(ju)(ju)(ju)集(ji)(ji)。然后(hou)與另一個配套的單細胞數(shu)據(ju)(ju)(ju)集(ji)(ji)整(zheng)合，使用iSpatial推斷形成(cheng)新的數(shu)據(ju)(ju)(ju)集(ji)(ji)。

通過將推斷的表達模式與Slide-seq（驗證數據組）確定的“真值”進行比較，我們發現iSpatial可以高精度地預測空間表達模式。例如，iSpatial推斷出Atp2b1，Prox1和Fibcd1的表達。iSpatial可以“增強”原始數據中未被很好地檢測到的信號。例如，Slit1，Tspan18，Efnb2，Car12等幾乎無法在海馬細胞中通過Slide-seq檢測到。

隨后開發團隊使用Slide-seq數據集(ji)進一步比(bi)較了iSpatial與另外(wai)兩個現(xian)有工具Liger和(he)Seurat在同一任務(wu)上(shang)(shang)的(de)(de)性(xing)能：與iSpatial相(xiang)(xiang)比(bi)，從(cong)Liger和(he)Seurat獲得的(de)(de)空間模式在較高(gao)背景下更模糊；在不同表(biao)達水平(ping)(ping)的(de)(de)所有基(ji)因(yin)組中，iSpatial表(biao)現(xian)出明顯高(gao)于其他方法的(de)(de)相(xiang)(xiang)關系數和(he)較低的(de)(de)RMSE，而且(qie)預(yu)測的(de)(de)準確(que)性(xing)與基(ji)因(yin)表(biao)達水平(ping)(ping)呈(cheng)正相(xiang)(xiang)關。此(ci)外(wai)，細胞類型(xing)特異性(xing)表(biao)達的(de)(de)基(ji)因(yin)表(biao)現(xian)出更高(gao)的(de)(de)預(yu)測準確(que)性(xing)。這一結果表(biao)明，iSpatial在功能相(xiang)(xiang)關的(de)(de)基(ji)因(yin)上(shang)(shang)實(shi)現(xian)了更高(gao)的(de)(de)預(yu)測準確(que)性(xing)。當(dang)比(bi)較從(cong)原始Slide-seq數據識(shi)別的(de)(de)SVG和(he)從(cong)不同方法推(tui)斷(duan)的(de)(de)數據識(shi)別的(de)(de)SVG時發現(xian)iSpatial在三種(zhong)方法中對SVG具有最高(gao)的(de)(de)預(yu)測能力。

開(kai)發團隊還使用了成年小鼠(shu)冠狀半腦切(qie)片的(de)Stereo-seq數據來衡量iSpatial的(de)性能(neng)。結(jie)果顯示，iSpatial在驗證(zheng)數據集上取(qu)得了比其他(ta)方法更高的(de)相關性。

2.iSpatial廣泛適用于不同的ST數據集

測試數據：使(shi)用(yong)iSpatial來(lai)分析覆蓋小(xiao)鼠大腦初級視(shi)覺皮層（V1）的STARmap數據集。原始的STARmap數據僅包含(han)1020個基(ji)因靶點，但是iSpatial推斷出(chu)超過20，000個基(ji)因的表達。重(zhong)要的是，不僅檢測到這些在(zai)STARmap沒有檢測到的基(ji)因，還能定(ding)量其表達量。

測試數(shu)據(ju)：小鼠紋(wen)狀體(ti)MERFISH數(shu)據(ju)集(ji)(ji)(ji)。原始的(de)MERFISH數(shu)據(ju)集(ji)(ji)(ji)包含(han)253個靶基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)，可以識別紋(wen)狀體(ti)中的(de)九種主要細胞類型，其(qi)中175個靶基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)在某些細胞類型中表(biao)現出(chu)顯著的(de)富集(ji)(ji)(ji)。通過(guo)將該數(shu)據(ju)集(ji)(ji)(ji)與相應的(de)scRNA-seq數(shu)據(ju)集(ji)(ji)(ji)整合，iSpatial可以在單細胞分辨率下推(tui)斷出(chu)約9000個基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)表(biao)達(da)和位置，其(qi)中超過(guo)2200個基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)被鑒定為細胞類型特異(yi)性表(biao)達(da)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)。推(tui)斷基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)空(kong)間(jian)模式(shi)與ISH確定的(de)空(kong)間(jian)模式(shi)基(ji)本一致(zhi)。

通過(guo)將(jiang)iSpatial應用于來自不同組(zu)織（海馬(ma)、大腦(nao)半球、皮層、紋狀體和(he)(he)肝臟）和(he)(he)用不同技術（Slide-seq、Stereo-seq、MERFISH和(he)(he)STARmap）生成(cheng)的數(shu)據(ju)集(ji)(ji)，在每個數(shu)據(ju)集(ji)(ji)中都發現了(le)已知和(he)(he)以前未知的空間表(biao)(biao)達模(mo)式(shi)，表(biao)(biao)明iSpatial廣泛適用于分析不同ST數(shu)據(ju)集(ji)(ji)。

3.iSpatial減少來自空間轉錄組的FP和FN信號

盡管相(xiang)(xiang)比于(yu)(yu)基(ji)于(yu)(yu)測序的(de)(de)ST技術(shu)，基(ji)于(yu)(yu)圖(tu)像的(de)(de)ST技術(shu)具有更(geng)高(gao)的(de)(de)檢(jian)測效率，但是這種技術(shu)的(de)(de)性(xing)(xing)能表現高(gao)度(du)依(yi)賴于(yu)(yu)基(ji)因(yin)(yin)探針的(de)(de)特性(xing)(xing)。例如(ru)，一些(xie)一些(xie)轉錄本太短(duan)，無(wu)法被(bei)足夠(gou)的(de)(de)探針靶(ba)向到，因(yin)(yin)而(er)(er)產生(sheng)假(jia)陰性(xing)(xing)（FN，dropout）。另一方面(mian)，一些(xie)基(ji)因(yin)(yin)由于(yu)(yu)具有相(xiang)(xiang)近的(de)(de)同源物，因(yin)(yin)此可能很難通過雜交區(qu)(qu)分，因(yin)(yin)而(er)(er)導致假(jia)陽性(xing)(xing)（FP，background）。作者認為(wei)iSpatial可以在進行(xing)表達預測時，通過給scRNA-seq細(xi)胞更(geng)高(gao)的(de)(de)權(quan)重來減少這些(xie)錯(cuo)誤信號。單細(xi)胞測序獲(huo)得的(de)(de)細(xi)胞對檢(jian)測基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)長度(du)不敏感(gan)，而(er)(er)且可以根據(ju)序列差異明(ming)確區(qu)(qu)分相(xiang)(xiang)似的(de)(de)轉錄本。

測試數據：比較原始STARmap數據和iSpatial推斷數據之間的UMAP上一些成熟細胞類型標記基因的表達模式。我們發現，盡管這些細胞類型特異性標記物在相應的細胞類型中表現出高富集性，但在STARmap分析時，通常存在FP信號（例如，Slc17a7，Gad1，Plp1和Cldn5）。在某些情況下，沒有觀察到預期的表達模式，可能是由于FN（Aqp4）。而iSpatial推斷的結果可以減少FP和FN的發生。

4.iSpatial 支持整個轉錄組水平的空間分析

ST分(fen)析的(de)一個(ge)(ge)主要目(mu)標是識(shi)別(bie)SVGs，這是不(bu)同(tong)組織結(jie)構/功能(neng)異質(zhi)性(xing)的(de)分(fen)子基礎(chu)。將iSpatial應用到STARmap皮層(ceng)數(shu)據以識(shi)別(bie)SVG，發現iSpatial可(ke)(ke)以顯著(zhu)增加(jia)檢測到的(de)SVG數(shu)量（從21個(ge)(ge)增加(jia)到2122個(ge)(ge)），iSaptial可(ke)(ke)以幫助識(shi)別(bie)生物(wu)學相(xiang)關的(de)空(kong)間(jian)基因(yin)表達(da)模(mo)式。svg的(de)聚類分(fen)析揭(jie)示了6種(zhong)主要的(de)空(kong)間(jian)模(mo)式，它(ta)們(men)類似于(yu)已(yi)知的(de)小鼠皮層(ceng)層(ceng)組織。值(zhi)得注意的(de)是，即(ji)使我們(men)將分(fen)析局(ju)限(xian)于(yu)STARmap的(de)目(mu)標基因(yin)，iSpatial仍然識(shi)別(bie)出更(geng)多的(de)SVGs(推斷數(shu)據162個(ge)(ge)，原(yuan)始數(shu)據21個(ge)(ge))，這可(ke)(ke)能(neng)是由于(yu)原(yuan)始數(shu)據中(zhong)FP和FN信號的(de)校正。

5.iSpatial改進了肝臟ST數據的分析

為了(le)評估iSpatial在其他組織(zhi)（除腦組織(zhi)之外(wai)）數(shu)(shu)據集中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)性能，開發團隊分析(xi)了(le)Vizgen MERFISH小鼠肝(gan)臟(zang)圖(tu)譜(pu)數(shu)(shu)據集，iSpatial成功地推(tui)斷(duan)出(chu)每(mei)個單個細胞(bao)中平(ping)均(jun)6000多個基因(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)，比原始數(shu)(shu)據增加了(le)20倍以(yi)上。推(tui)斷(duan)出(chu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)空(kong)間模(mo)式(shi)與現有(you)知識基本一(yi)致。在iSpatial推(tui)斷(duan)表(biao)達(da)譜(pu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基礎(chu)上進一(yi)步(bu)生(sheng)成了(le)UMAP，發現細胞(bao)在UMAP上的(de)(de)(de)(de)(de)(de)位置與它(ta)們沿(yan)CV-PV軸的(de)(de)(de)(de)(de)(de)原位分布密切(qie)相關，顯示(shi)了(le)沿(yan)CV-PV軸的(de)(de)(de)(de)(de)(de)梯(ti)(ti)度表(biao)達(da)譜(pu)。值得(de)注(zhu)意的(de)(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)，盡管Liger和Seurat也能揭示(shi)類似的(de)(de)(de)(de)(de)(de)梯(ti)(ti)度表(biao)達(da)模(mo)式(shi)，但三種方(fang)法的(de)(de)(de)(de)(de)(de)比較表(biao)明，iSpatial取得(de)了(le)更高的(de)(de)(de)(de)(de)(de)特異性和準確性，特別是(shi)對具(ju)有(you)更多空(kong)間限制的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)模(mo)式(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基因(yin)。總(zong)之，iSpatial可以(yi)克服各種ST分析(xi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)目標基因(yin)數(shu)(shu)量有(you)限的(de)(de)(de)(de)(de)(de)問題，在不同組織(zhi)中達(da)到全(quan)轉錄組水平(ping)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)高精確度。