帕(pa)金(jin)森(sen)（PD）是(shi)在(zai)老(lao)年人(ren)群中繼老(lao)年癡呆(dai)癥(AD)后的(de)第二(er)大精神退行(xing)性疾病(bing)，帕(pa)金(jin)森(sen)病(bing)的(de)特征(zheng)是(shi)黑質多巴胺能神經元的(de)喪(sang)失。導致(zhi)嚴重(zhong)的(de)進行(xing)性運(yun)動障(zhang)礙(ai)，包括運(yun)動遲緩、休(xiu)息(xi)性震顫、僵硬和(he)各(ge)種非運(yun)動癥狀，如情緒障(zhang)礙(ai)，影(ying)響與冷漠，和(he)認知(zhi)功能障(zhang)礙(ai)。全世界有超過1000萬人(ren)患有PD, 80%的(de)PD患者最終會發展(zhan)成癡呆(dai)。

越來(lai)越多(duo)(duo)的(de)(de)(de)證(zheng)(zheng)據(ju)表明，免(mian)(mian)疫(yi)(yi)失調在PD的(de)(de)(de)疾病(bing)進(jin)展中(zhong)發揮了關鍵的(de)(de)(de)作(zuo)用，包括(kuo)與自身免(mian)(mian)疫(yi)(yi)疾病(bing)、細(xi)胞(bao)(bao)和(he)體液免(mian)(mian)疫(yi)(yi)功能(neng)(neng)障(zhang)礙的(de)(de)(de)臨床和(he)遺傳(chuan)聯系，PD實驗模型(xing)(xing)中(zhong)炎癥細(xi)胞(bao)(bao)激活和(he)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)調節障(zhang)礙的(de)(de)(de)影像學(xue)證(zheng)(zheng)據(ju)。這一復(fu)雜(za)的(de)(de)(de)疾病(bing)可(ke)能(neng)(neng)起(qi)源于自身的(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)紊亂，盡管已有大量文獻，但許(xu)多(duo)(duo)問題仍未得(de)到解(jie)決(jue)。一方面，有研究(jiu)表明PD患者(zhe)的(de)(de)(de)外(wai)周(zhou)血(xue)(xue)中(zhong)存(cun)在T細(xi)胞(bao)(bao)比例的(de)(de)(de)變(bian)化，但每個細(xi)胞(bao)(bao)亞型(xing)(xing)對疾病(bing)病(bing)因的(de)(de)(de)相對貢獻仍不(bu)清(qing)楚；另一方面，據(ju)報(bao)道，CD8+和(he)CD4+ T細(xi)胞(bao)(bao)在死后人(ren)PD標本和(he)PD小鼠(shu)模型(xing)(xing)中(zhong)都能(neng)(neng)侵(qin)入大腦(nao)，但人(ren)外(wai)周(zhou)血(xue)(xue)和(he)腦(nao)脊液中(zhong)T細(xi)胞(bao)(bao)亞型(xing)(xing)的(de)(de)(de)組成(cheng)和(he)相互作(zuo)用以及它們滲入中(zhong)樞神經系統的(de)(de)(de)潛在能(neng)(neng)力(li)尚(shang)不(bu)清(qing)楚。

單細(xi)(xi)胞(bao)測序是揭示復雜(za)器官(guan)異質性(xing)的(de)(de)一把利刃，單細(xi)(xi)胞(bao)轉錄組能(neng)提供(gong)每(mei)個細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)表達譜，單細(xi)(xi)胞(bao)TCR測序能(neng)提供(gong)每(mei)個細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)TCR序列(lie)，相同(tong)的(de)(de)TCR序列(lie)暗示了(le)T細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)克(ke)隆擴增模式和T細(xi)(xi)胞(bao)譜系(xi)，這對(dui)識(shi)別由主(zhu)要(yao)組織相容(rong)性(xing)復合(he)體(ti)(MHC)呈現(xian)的(de)(de)內(nei)源性(xing)和外(wai)源性(xing)抗原至關(guan)重要(yao)。最近，單細(xi)(xi)胞(bao)轉錄組和TCR測序被(bei)應(ying)(ying)用(yong)于(yu)分(fen)析阿爾茨(ci)海(hai)默病和多發性(xing)硬化癥患者的(de)(de)免疫細(xi)(xi)胞(bao)，揭示了(le)T細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)擴增特征及(ji)其與神經系(xi)統炎癥的(de)(de)關(guan)系(xi)。淋巴細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)大規(gui)模單細(xi)(xi)胞(bao)測序可能(neng)有助(zhu)于(yu)我們更好地了(le)解PD的(de)(de)適應(ying)(ying)性(xing)免疫反(fan)應(ying)(ying)。

本研究聯合了單(dan)細(xi)(xi)(xi)胞轉錄組(zu)和(he)TCR測序來(lai)系(xi)(xi)統的(de)(de)描述PD患者(zhe)的(de)(de)外(wai)周血和(he)腦(nao)脊液中T淋巴細(xi)(xi)(xi)胞的(de)(de)組(zu)成(cheng)，功能(neng)和(he)譜系(xi)(xi)之間的(de)(de)關(guan)系(xi)(xi)。總共從103,365個T細(xi)(xi)(xi)胞中鑒定出21個具有不同(tong)功能(neng)的(de)(de)T細(xi)(xi)(xi)胞亞群。對單(dan)細(xi)(xi)(xi)胞基因(yin)表(biao)達和(he)TCRs的(de)(de)綜合分析揭示了這些亞型的(de)(de)連(lian)通性和(he)潛在分化(hua)軌(gui)跡，并提供(gong)了PD患者(zhe)血液和(he)腦(nao)脊液中巡邏(luo)的(de)(de)T淋巴細(xi)(xi)(xi)胞克隆擴(kuo)增的(de)(de)新證據。這種空前大規模的(de)(de)T細(xi)(xi)(xi)胞轉錄組(zu)和(he)免疫(yi)分析數據可作為研究PD基本特征的(de)(de)寶貴資源，并可能(neng)指導有效(xiao)的(de)(de)免疫(yi)治療(liao)策略。

我(wo)們(men)對(dui)PD患者血液(ye)和腦脊液(ye)中(zhong)T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的單細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)轉錄組和TCR譜(pu)進行了(le)全面分析。采集(ji)8例(li)PD患者和6例(li)健康(kang)對(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)者的新鮮血液(ye)樣本。用流式細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)術對(dui)CD3+ T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)進行分類(lei)，在10×平臺(10× Genomics, CA, USA)上制(zhi)備(bei)單細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)5’基(ji)因表達和V(D)J文庫。另外7個(ge)健康(kang)對(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)的單細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)數(shu)(shu)(shu)據集(ji)從公開的數(shu)(shu)(shu)據集(ji)下(xia)載(zai)。此外，我(wo)們(men)還比(bi)較了(le)腦脊液(ye)中(zhong)公開的單細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)免疫分析數(shu)(shu)(shu)據集(ji)，包(bao)括6名PD患者和9名健康(kang)對(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)，以更(geng)好地了(le)解PD中(zhong)淋巴細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的克隆擴增。我(wo)們(men)總共獲得了(le)103,365個(ge)T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的單細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)轉錄組數(shu)(shu)(shu)據和113,690個(ge)T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的單細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)TCR測(ce)序數(shu)(shu)(shu)據，其中(zhong)84,384個(ge)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)同時具有基(ji)因表達和TCR譜(pu)數(shu)(shu)(shu)據。

識別出21個(ge)(ge)(ge)不(bu)同(tong)(tong)的(de)(de)集(ji)(ji)(ji)群(qun)，代(dai)表(biao)(biao)不(bu)同(tong)(tong)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型，包括(kuo)11個(ge)(ge)(ge)集(ji)(ji)(ji)群(qun)的(de)(de)常規CD4+ T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，2個(ge)(ge)(ge)集(ji)(ji)(ji)群(qun)的(de)(de)調節(jie)性(xing)CD4+ T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，5個(ge)(ge)(ge)集(ji)(ji)(ji)群(qun)的(de)(de)CD8+ T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，1個(ge)(ge)(ge)gamma delta T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)集(ji)(ji)(ji)群(qun)，1個(ge)(ge)(ge)MAIT細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)集(ji)(ji)(ji)群(qun)和1個(ge)(ge)(ge)雙(shuang)陰性(xing)T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)集(ji)(ji)(ji)群(qun)。通過評估經典標記(ji)基因的(de)(de)表(biao)(biao)達及其與純化的(de)(de)bulk RNA-seq數據集(ji)(ji)(ji)的(de)(de)表(biao)(biao)達相(xiang)似(si)性(xing)，注(zhu)釋細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型。主要(yao)包括(kuo)5種細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型，包括(kuo)CD8+ T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(CD8)、CD4+ T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(CD4)、黏膜相(xiang)關不(bu)變T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(MAIT)、伽(jia)馬δ T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(gdT)和雙(shuang)陰性(xing)T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(DNT)。

對于CD4+ T細胞，3個聚類(C2、C4和C8聚類)被注釋為na?ve CD4+ T細胞，其特征為na?ve T細胞標記SELL、CCR7、TCF7和LEF1;通過與純化免疫細胞的海量RNA-seq數據集的相關性分析，將C1、C9、C7、C12和C19分別注釋為中央記憶CD4+ T細胞、經典的Th1、Th2、Th17和Tfh細胞。C13被注釋為細胞毒性CD4+ T細胞(CD4 CTL)， CD4和細胞毒性基因GZMA、GZMB、PRF1和NKG7高表達;C17和C18被注釋為高表達Treg標記FOXP3、CTLA4、TIGIT和IL2RA的調節性CD4+ T細胞;由于證據不足，C20和C21未被指定為特定的CD4+ T細胞類型。

對于CD8+ T細胞，C5簇被注釋為na?ve CD8+ T細胞，高表達na?ve細胞標記SELL, CCR7, TCF7和LEF1;2簇(C6和C11)被注釋為末端效應CD8+ T細胞，其特征為效應標記物，如GZMA、GZMB、PRF1、NKG7;C3簇被注釋為高表達過渡標記基因GZMK的過渡CD8+ T細胞，C15簇被注釋為高表達CD27、SELL和CCR7的中央記憶CD8+ T細胞(TCM)。

其余T細胞形成3個簇，其中gamma - delta T細胞簇1個，MAIT細胞簇1個，雙陰性T細胞簇1個。C10標記為Vd2 γ δ T細胞，其中93%的細胞高表達TRDV2和TRGV9基因，93%的細胞未檢測到αβTCR。總的來說，來自C10的69%的細胞被純化的大量RNA-seq數據集注釋為Vd2 gd T細胞。C16被注釋為雙陰性T細胞，其中超過60%的細胞既不表達CD4也不表達CD8，C14以TCRα鏈中TRAV1-2和TRAJ33基因片段重組比例的絕對優勢被注釋為MAIT細胞;相關分析也顯示與純化的MAIT細胞最相似。

為(wei)了(le)了(le)解PD患者是否遵循(xun)報道的(de)T淋巴細胞變化10，我(wo)們比(bi)較(jiao)了(le)PD患者和健康對(dui)(dui)照組(zu)血液(ye)中CD4+ T細胞和CD8+ T細胞的(de)比(bi)例(li)。在我(wo)們的(de)單細胞轉(zhuan)錄組(zu)分析中，PD患者血液(ye)中CD8+ T細胞的(de)比(bi)例(li)明(ming)顯(xian)高于(yu)健康對(dui)(dui)照組(zu)(T檢驗，p值(zhi)= 0.018)，而(er)CD4+ T細胞的(de)比(bi)例(li)明(ming)顯(xian)低于(yu)健康對(dui)(dui)照組(zu)(T檢驗，p值(zhi)= 0.014)。PD患者的(de)總CD4/CD8比(bi)值(zhi)(比(bi)值(zhi)= 1.66)明(ming)顯(xian)低于(yu)健康對(dui)(dui)照組(zu)(比(bi)值(zhi)= 2.44)(t檢驗，p值(zhi)= 0.0048)。已發表的(de)研(yan)究表明(ming)，健康成人外周(zhou)血中CD4/CD8比(bi)值(zhi)約為(wei)2:1，比(bi)值(zhi)的(de)改變表明(ming)疾病與免(mian)疫缺陷或自身免(mian)疫相(xiang)關。CD4/CD8比(bi)值(zhi)顯(xian)著降低可能(neng)提示(shi)PD患者存在免(mian)疫紊亂。

為了(le)深入了(le)解(jie)PD中(zhong)T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)克(ke)(ke)(ke)隆擴增，我們對(dui)(dui)PD患者和健康(kang)(kang)對(dui)(dui)照組(zu)的(de)(de)scTCR-seq數據(ju)進行了(le)比較分析。TCR α-鏈(lian)和β-鏈(lian)CDR3序列(lie)相同(tong)的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)被定義為相同(tong)的(de)(de)克(ke)(ke)(ke)隆型(xing)。我們從單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)TCR測序數據(ju)中(zhong)檢(jian)測到113,690個(ge)(ge)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，形(xing)成87,832個(ge)(ge)獨特的(de)(de)克(ke)(ke)(ke)隆型(xing)，其中(zhong)4458個(ge)(ge)克(ke)(ke)(ke)隆型(xing)包含至少兩(liang)個(ge)(ge)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，表明T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)克(ke)(ke)(ke)隆擴展。PD患者血液中(zhong)的(de)(de)T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)多(duo)樣性明顯(xian)低于健康(kang)(kang)對(dui)(dui)照組(zu)(T檢(jian)驗，p值(zhi)= 6.87E?3)。與健康(kang)(kang)對(dui)(dui)照組(zu)相比，PD患者具有相同(tong)克(ke)(ke)(ke)隆大(da)小的(de)(de)克(ke)(ke)(ke)隆型(xing)數量(liang)顯(xian)著增加(jia)(100個(ge)(ge)隨機抽樣試驗，中(zhong)位p值(zhi)= 5.98e?7）。這(zhe)些結果表明PD患者血液中(zhong)存在T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)克(ke)(ke)(ke)隆擴增。

在腦(nao)脊液(ye)中，PD患(huan)者的(de)T細(xi)(xi)胞(bao)多樣性較健(jian)康對(dui)照組(zu)略(lve)有降低，統計學p值(zhi)(zhi)不顯著(zhu)，這可能與檢測細(xi)(xi)胞(bao)數量少、樣本數量少有關(T檢驗(yan)，p值(zhi)(zhi)= 0.076，補充圖S2a)。然(ran)而(er)，與健(jian)康對(dui)照組(zu)相比，PD患(huan)者腦(nao)脊液(ye)中具有相同克隆大小的(de)克隆型數量顯著(zhu)增加(100例隨機抽樣試驗(yan)，中位p值(zhi)(zhi)= 6.25e?3）。PD患(huan)者腦(nao)脊液(ye)中克隆大小為> 2的(de)T細(xi)(xi)胞(bao)比例明顯高于健(jian)康對(dui)照組(zu)(T檢驗(yan)，p值(zhi)(zhi)= 0.033)。這些結果(guo)表(biao)明，PD患(huan)者的(de)腦(nao)脊液(ye)中也存在T細(xi)(xi)胞(bao)克隆擴(kuo)增。

克(ke)(ke)隆擴增的T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)廣泛分(fen)布在每個簇(cu)中，特(te)別是CD8+ T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，每個血液樣(yang)(yang)本中按克(ke)(ke)隆大(da)小分(fen)布的T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)組(zu)成(cheng)(NA， = 1，≥2，≥20，≥100,NA表示這些細(xi)胞(bao)(bao)(bao)中未(wei)檢測(ce)到TCR)。與健康對照組(zu)相比，PD患者(zhe)血液中克(ke)(ke)隆大(da)小≥2和≥100的T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)百分(fen)比顯(xian)著增加(T檢驗，P值分(fen)別為(wei)0.0030和0.0074)。我(wo)們(men)觀(guan)察到，每個樣(yang)(yang)本中的細(xi)胞(bao)(bao)(bao)類(lei)型(xing)組(zu)成(cheng)因(yin)克(ke)(ke)隆大(da)小而(er)不(bu)(bu)同。scTCR-seq中檢測(ce)到的不(bu)(bu)含(han)αβTCR的T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)主(zhu)要為(wei)Vd2 gd T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，而(er)只含(han)一個細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的克(ke)(ke)隆型(xing)主(zhu)要為(wei)na?ve CD4+ T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)。較大(da)的克(ke)(ke)隆型(xing)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)類(lei)型(xing)分(fen)布不(bu)(bu)均(jun)勻，過渡和終(zhong)末效(xiao)應因(yin)子CD8+ T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)富集。

我們對所(suo)有PD患者和健康對照組的(de)(de)(de)CD8+ T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)進行(xing)了(le)深入(ru)分(fen)(fen)析。有趣(qu)的(de)(de)(de)是(shi)，PD患者血液(ye)中CD8+ T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)表(biao)現出不(bu)均勻的(de)(de)(de)功能狀態分(fen)(fen)布，顯(xian)(xian)著富(fu)(fu)集(ji)的(de)(de)(de)終(zhong)端(duan)效(xiao)應CD8+ T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(C6簇(cu)(cu)，T檢(jian)驗(yan)，FDR = 0.015)， 耗(hao)竭的(de)(de)(de)na?ve CD8+ T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(C5簇(cu)(cu)，T檢(jian)驗(yan)，FDR = 0.012)。在這5個CD8+ T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)簇(cu)(cu)中，標記(ji)基因(yin)的(de)(de)(de)表(biao)達明(ming)顯(xian)(xian)波動，終(zhong)端(duan)效(xiao)應CD8+ T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)表(biao)現出更廣泛和更高(gao)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)毒性(xing)基因(yin)表(biao)達。Fisher確切檢(jian)驗(yan)顯(xian)(xian)示PD患者克隆擴增的(de)(de)(de)T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)明(ming)顯(xian)(xian)富(fu)(fu)集(ji)過渡性(xing)和終(zhong)末效(xiao)應因(yin)子(zi)CD8+ T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，尤其是(shi)C3和C6簇(cu)(cu)(Fisher確切檢(jian)驗(yan)，FDR分(fen)(fen)別為1.10e-46和1.02 -8)。

為了進一步了解CD8+ T細胞簇之間的關系，我們使用擴散圖在偽時間軌跡上可視化這些細胞，有趣的是，第一個擴散成分將中央記憶細胞從活化的CD8+ T細胞中分離出來，并與細胞毒性相關基因(如GZMH、PRF1、FGFBP2)以及調節細胞遷移和粘附的蛋白(如CX3CR1和ADGRG)高度相關。第二個擴散組分顯示末端效應因子CD8+ T細胞的兩個不同分化方向。上層分支(C6簇)與細胞粘附蛋白ITGAM、ITGB1、組織駐T細胞轉錄調節蛋白ZNF683(編碼Hobit)高度相關，下層分化分支(C11簇)與殺傷樣受體KLRC3、KLRF1、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體KIR2DL3、KIR3DL2高度相關。

為了進一步了解末端效應因子CD8+ T細胞之間的功能差異，我們分析了上分化分支和下分化分支(C6和C11簇)之間的差異表達基因。上支(C6簇)高表達細胞粘附和遷移基因，如ITGAM、ITGB1、CD226和S100A4;T細胞活化和增殖標志物，如CD52和S100A6;和組織駐留T細胞轉錄調節蛋白ZNF683 (Hobit)。KEGG通路分析結果顯示，C6上調基因與細胞粘附分子(KEGG: hsa04514, FDR = 0.0015)和白細胞跨內皮遷移(KEGG: hsa04670, FDR = 0.0047)高度相關。這表明這些細胞可能參與了組織免疫。與細胞存活和細胞毒功能相關的基因如PRSS23、SPON2和ZNF683 (Hobit)也在C6簇中高表達。低分支(C11簇)高表達基因富集于自然殺傷細胞介導的細胞毒性途徑(KEGG: hsa04650, FDR = 2.78e?10)，包括殺傷樣受體KLRC3、KLRF1和KLRB1以及殺傷細胞免疫球蛋白樣受體KIR3DL1、KIR3DL2和KIR2DL3。這組CD8+ T細胞的功能更像非經典的NKT細胞。

此外，從擴散軌跡(ji)中(zhong)(zhong)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞的(de)樣(yang)本(ben)組成分(fen)(fen)布(bu)(bu)可以看出，PD患者(zhe)血液(ye)中(zhong)(zhong)CD8+ T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞的(de)比例隨(sui)著分(fen)(fen)化(hua)(hua)(hua)過程(cheng)(cheng)逐漸增(zeng)加，尤其是在分(fen)(fen)化(hua)(hua)(hua)的(de)上層分(fen)(fen)支(zhi)。較大的(de)克(ke)(ke)隆(long)型(xing)(xing)往往位于執行器分(fen)(fen)支(zhi)的(de)末(mo)端。PD患者(zhe)血液(ye)中(zhong)(zhong)由中(zhong)(zhong)樞記憶(yi)CD8+ T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(C15簇(cu)(cu)(cu))向移行CD8+ T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(C3簇(cu)(cu)(cu))轉化(hua)(hua)(hua)，然后是末(mo)端效應(ying)(ying)CD8+ T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(C6簇(cu)(cu)(cu))的(de)過程(cheng)(cheng)。共享(xiang)相(xiang)同(tong)TCRs的(de)T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞克(ke)(ke)隆(long)型(xing)(xing)的(de)分(fen)(fen)布(bu)(bu)進一(yi)步(bu)支(zhi)持了這(zhe)種轉化(hua)(hua)(hua)。追蹤T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞克(ke)(ke)隆(long)型(xing)(xing)和(he)轉錄表(biao)型(xing)(xing)，我(wo)們發現55種克(ke)(ke)隆(long)型(xing)(xing)包(bao)含(han)分(fen)(fen)布(bu)(bu)在中(zhong)(zhong)央(yang)記憶(yi)CD8+ T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(C15簇(cu)(cu)(cu))、移行CD8+ T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(C3簇(cu)(cu)(cu))和(he)末(mo)端效應(ying)(ying)CD8+ T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(C6簇(cu)(cu)(cu))中(zhong)(zhong)的(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞，如克(ke)(ke)隆(long)23型(xing)(xing)、克(ke)(ke)隆(long)24型(xing)(xing)、克(ke)(ke)隆(long)38型(xing)(xing)和(he)克(ke)(ke)隆(long)103型(xing)(xing)。提示(shi)TCRs可能參與PD患者(zhe)CD8+ T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞分(fen)(fen)化(hua)(hua)(hua)過程(cheng)(cheng)。總之，這(zhe)些結果揭(jie)示(shi)了一(yi)個獨特的(de)末(mo)端效應(ying)(ying)CD8+ T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞簇(cu)(cu)(cu)(C6簇(cu)(cu)(cu))，它在PD患者(zhe)中(zhong)(zhong)通(tong)過TCR激活(huo)表(biao)現出明顯的(de)克(ke)(ke)隆(long)擴展(zhan)和(he)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞毒(du)性(xing)分(fen)(fen)化(hua)(hua)(hua)，并通(tong)過表(biao)達與細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞粘(zhan)附、遷移、生存和(he)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞毒(du)性(xing)相(xiang)關的(de)眾多基(ji)因來區(qu)分(fen)(fen)。

CD4+ T細胞是一大批在PD的外周免疫中發揮重要作用的細胞。我們注釋了8種主要的CD4+ T細胞亞型，包括na?ve CD4+ T細胞(C2、C4和C8簇)、中樞記憶CD4+ T細胞(C1簇)、細胞毒性CD4+ T細胞(CD4 CTL, C13簇)、Th1細胞(C9簇)、Th2細胞(C7簇)、Th17細胞(C12簇)、Tfh細胞(C19簇)和調節性T細胞(C17和C18簇)。每個簇中都有一些高表達的基因。CD4 ctl (C13簇)CD4和幾種細胞毒基因如GZMA、GZMB、GZMH和NKG7的表達顯著升高。PD患者與健康對照組CD4+ T細胞亞型組成無明顯差異。為了了解這些CD4+ T細胞之間的關系，我們使用R包Monocle 2(2.14.0版本)構建了單細胞軌跡。選擇中央記憶T細胞(C1簇，TCM)作為分化的起始細胞類型。與聚類分析一致，我們觀察到一個從中央記憶T細胞(C1集群，TCM)到效應T細胞(C9, C7和C12集群，TEM)的轉化過程，然后是CD4 CTL (C13集群，CTL)。調節性CD4+ T細胞(C17和C18簇，treg)合理地位于不同的分支。

為了深入了解CD4+ T細胞之間的克隆關系，我們使用Fisher 's精確測試來識別pd特異性克隆擴增的CD4+ T細胞簇。與健康對照組相比，PD患者血液中Th1細胞和CD4 ctl (C9和C13簇)中克隆擴增的CD4+ T細胞顯著增加(Fisher確切檢驗，FDR分別為8.58e?28和3.92 2e?14)。具體而言，PD患者血液中的Th1細胞占Th1細胞總數(C9簇)的50.2%，當背景減少為克隆擴增的Th1細胞時，這一比例增加到65.5%。至于CD4 ctl (C13聚類)，該人群中74.4%來自PD患者的血液，當背景減少到克隆擴增CD4 ctl時，這一比例增加到77.3%。PD患者的CD4 ctl具有較大的克隆型，從2301個細胞中檢測出371個克隆型(每個克隆型6.2個細胞)，而健康對照組的平均克隆大小為3.2(從829個細胞中檢測出258個克隆型。我們使用擴散圖進一步可視化TCM、Th1、Th2和CD4 ctl之間的關系。較大的克隆型傾向于分布在CTL分支的末端。PD細胞的比例沿軌跡逐漸增加。CD4 CTLs中富集的4個主要細胞毒基因GZMA、GZMB、PRF1和NKG7的平均表達量沿CD4 ctl分化軌跡增加。TCR共享的證據進一步支持從Th1細胞到CD4 ctl的狀態轉變。在Th1細胞和CD4 ctl中共鑒定出81種克隆型，如克隆型28和克隆型65。這些結果表明，一組來自TCR激活的Th1細胞的CD4 ctl在PD患者中顯著克隆擴增。

Th1細(xi)(xi)胞(bao)可(ke)通過釋放(fang)IFNγ對(dui)多(duo)巴(ba)胺能神經元(yuan)產生細(xi)(xi)胞(bao)毒性作用，IFNγ激活并招募(mu)其他免疫(yi)細(xi)(xi)胞(bao)放(fang)大局(ju)部炎癥。也有報道(dao)稱CD4+ T細(xi)(xi)胞(bao)介導(dao)的(de)多(duo)巴(ba)胺能毒性在(zai)PD11小鼠模型中(zhong)(zhong)不(bu)需(xu)要(yao)IFNγ的(de)表(biao)達，提(ti)示細(xi)(xi)胞(bao)毒性CD4+ T細(xi)(xi)胞(bao)浸潤中(zhong)(zhong)樞神經系(xi)統的(de)存在(zai)。我們(men)的(de)研究(jiu)發現，PD患者(zhe)血(xue)(xue)液(ye)中(zhong)(zhong)Th1和CD4 CTL均通過tcr依賴性活化顯著克隆擴增，提(ti)示血(xue)(xue)液(ye)中(zhong)(zhong)的(de)這(zhe)兩種細(xi)(xi)胞(bao)類型可(ke)能是中(zhong)(zhong)央(yang)浸潤性CD4+ T細(xi)(xi)胞(bao)的(de)來(lai)源。直接(jie)或間接(jie)靶向這(zhe)些(xie)T細(xi)(xi)胞(bao)類型的(de)抑制劑(ji)可(ke)能通過阻止T細(xi)(xi)胞(bao)增殖來(lai)阻斷PD患者(zhe)的(de)免疫(yi)反應。

越(yue)(yue)來越(yue)(yue)多(duo)的(de)證據表(biao)明(ming)，自身蛋(dan)白的(de)異常處理可(ke)在(zai)(zai)PD中產(chan)生抗(kang)原(yuan)。T細(xi)(xi)胞(bao)識別(bie)這些抗(kang)原(yuan)，協調(diao)局(ju)部先天免疫(yi)反應(ying)，并通過(guo)激活免疫(yi)途徑驅(qu)動多(duo)巴胺能神(shen)(shen)經(jing)(jing)元(yuan)死亡。α-突觸(chu)(chu)核蛋(dan)白(α-syn)是一種突觸(chu)(chu)前(qian)神(shen)(shen)經(jing)(jing)元(yuan)蛋(dan)白，在(zai)(zai)遺傳和(he)病理上與(yu)(yu)PD相(xiang)關。最(zui)近的(de)研究表(biao)明(ming)，α-syn纖維(wei)可(ke)以在(zai)(zai)大鼠腦內神(shen)(shen)經(jing)(jing)退行性變之前(qian)招募(mu)外周免疫(yi)細(xi)(xi)胞(bao)。錯誤(wu)折疊α-syn蛋(dan)白不僅在(zai)(zai)中樞神(shen)(shen)經(jing)(jing)系統(tong)中普遍存在(zai)(zai)，還會(hui)引(yin)起周圍免疫(yi)反應(ying)。一組來自α-syn的(de)肽被報道(dao)為驅(qu)動PD患(huan)者T細(xi)(xi)胞(bao)應(ying)答的(de)表(biao)位(wei)。此外，在(zai)(zai)PD中，線粒體抗(kang)原(yuan)呈遞途徑也與(yu)(yu)適應(ying)性免疫(yi)相(xiang)關。識別(bie)抗(kang)原(yuan)特異性T細(xi)(xi)胞(bao)對于理解PD的(de)適應(ying)性免疫(yi)反應(ying)至(zhi)關重(zhong)要。

基于CDR3序(xu)(xu)列(lie)相(xiang)似(si)性(xing)的(de)TCR聚(ju)類(lei)是識別抗(kang)原特(te)異(yi)性(xing)T細胞的(de)有效方法，因為來(lai)自(zi)不同個(ge)(ge)體的(de)TCR共享(xiang)相(xiang)似(si)基序(xu)(xu)可能(neng)也共享(xiang)抗(kang)原特(te)異(yi)性(xing)。總(zong)的(de)來(lai)說，我們從113,690個(ge)(ge)T細胞中獲得了110,912個(ge)(ge)βCDR3s，并進行了成對比對。我們使用(yong)了一種特(te)別設(she)計用(yong)于處理大量(liang)TCR聚(ju)類(lei)的(de)超快算(suan)法iSMART，檢測到1778個(ge)(ge)TCR特(te)異(yi)性(xing)組。為了識別PD特(te)異(yi)性(xing)TCR，我們篩(shai)選了67個(ge)(ge)TCR特(te)異(yi)性(xing)組，其中至(zhi)少有一種TCR來(lai)自(zi)PD患(huan)者(zhe)(zhe)的(de)血液(ye)，一種TCR來(lai)自(zi)PD患(huan)者(zhe)(zhe)的(de)CSF。這些組被認為是PD特(te)異(yi)性(xing)TCRs的(de)候選者(zhe)(zhe)，其中大多數(shu)僅在(zai)PD患(huan)者(zhe)(zhe)中發現。

pd特(te)異(yi)(yi)性(xing)(xing)TCRs的(de)(de)(de)鑒定(ding)也使我們(men)能(neng)夠進(jin)一步(bu)(bu)從pd相(xiang)關蛋(dan)白(如α-syn)中發現候(hou)選抗原(yuan)表位(wei)。我們(men)使用了(le)(le)幾(ji)個(ge)(ge)步(bu)(bu)驟來尋(xun)找(zhao)pd特(te)異(yi)(yi)性(xing)(xing)TCRs和(he)(he)(he)潛(qian)在(zai)抗原(yuan)表位(wei)之(zhi)間的(de)(de)(de)關系。首先，從我們(men)8例(li)PD患者的(de)(de)(de)全(quan)基(ji)(ji)因組(zu)測序(xu)(xu)(xu)數據中獲(huo)得(de)高分辨率(lv)HLA分型。其(qi)次(ci)，以“α- synuclein”和(he)(he)(he)“線粒(li)(li)體(ti)”為關鍵詞檢索NCBI蛋(dan)白數據庫，獲(huo)得(de)所有α-syn和(he)(he)(he)線粒(li)(li)體(ti)蛋(dan)白序(xu)(xu)(xu)列;去除(chu)冗余后，將這(zhe)(zhe)些蛋(dan)白質序(xu)(xu)(xu)列分別分離(li)為9-mer和(he)(he)(he)15-mer多肽(tai)，以預測它們(men)與MHC I和(he)(he)(he)MHC II等(deng)位(wei)基(ji)(ji)因的(de)(de)(de)結(jie)合(he)親(qin)和(he)(he)(he)力。最后，我們(men)利(li)用MHC基(ji)(ji)因和(he)(he)(he)TCRs共(gong)享的(de)(de)(de)樣(yang)本(ben)(ben)，構(gou)建了(le)(le)MHC肽(tai)和(he)(he)(he)TCRs之(zhi)間的(de)(de)(de)關系。14個(ge)(ge)TCR特(te)異(yi)(yi)性(xing)(xing)組(zu)和(he)(he)(he)11個(ge)(ge)HLA等(deng)位(wei)基(ji)(ji)因之(zhi)間存在(zai)相(xiang)對強的(de)(de)(de)樣(yang)本(ben)(ben)共(gong)享關系。這(zhe)(zhe)些HLA等(deng)位(wei)基(ji)(ji)因被(bei)預測與α-syn蛋(dan)白或線粒(li)(li)體(ti)蛋(dan)白的(de)(de)(de)至少一個(ge)(ge)肽(tai)結(jie)合(he)。幸(xing)運(yun)的(de)(de)(de)是(shi)，我們(men)預測的(de)(de)(de)兩(liang)個(ge)(ge)肽(tai)' KTKEGVLYVGSKTKE '和(he)(he)(he)' GKTKEGVLYVGSKTK '已(yi)被(bei)報道在(zai)PD患者中驅動輔(fu)助T細胞(bao)和(he)(he)(he)細胞(bao)毒性(xing)(xing)T細胞(bao)應答。綜(zong)上所述(shu)，我們(men)利(li)用TCR聚類和(he)(he)(he)機器學習(xi)篩選了(le)(le)一組(zu)pd特(te)異(yi)(yi)性(xing)(xing)TCR及(ji)其(qi)候(hou)選表位(wei)，為血(xue)和(he)(he)(he)腦脊液T細胞(bao)參與神經(jing)元變性(xing)(xing)提供了(le)(le)潛(qian)在(zai)靶點(dian)。

血腦屏障(BBB)是內皮細胞形成的一種物理屏障，防止血液蛋白質、抗體和免疫細胞穿透腦實質。然而，在慢性炎癥的持續作用下，內皮細胞之間的緊密連接被削弱或破壞，從而允許抗體或免疫細胞通過。腦的死后研究證實，淋巴細胞浸潤大腦有助于pd9,11,46的神經退行性變。炎癥期間白細胞，特別是淋巴細胞，在中樞神經系統(CNS)的招募中有大量的粘附分子參與。整合素白細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)通過結合內皮細胞表面的ICAM-1(和ICAM-2)在白細胞粘附級聯中發揮關鍵作用。極晚激活抗原-4 (VLA-4)介導淋巴細胞和單核細胞與激活內皮細胞表面VCAM-1的粘附。巨噬細胞-1抗原(MAC-1)結合ICAM-1(和ICAM-2)調節血管內爬行。此外，一些趨化因子及其受體與效應T細胞到血腦屏障的再循環有關。滾動白細胞上的趨化因子受體(如CXCR4)與內皮細胞上的趨化因子(如CXCL12)相互作用，激活若干信號通路(如PI3K、PLC、RAS-和rho -家族GTPase和MAPK)，促進整合素構象的開放。選擇素(SELE, SELP)及其對抗配體(SELPLG)依賴滾動是白細胞向炎癥組織募集的最早可觀察事件，它在多發性硬化癥患者急性發作時腦血管中CD8+細胞募集中起著關鍵作用。

我們評估了許多與細胞遷移和粘附相關的分子，發現許多與血腦屏障滲透相關的分子在細胞毒性T細胞中高度表達。整合素家族基因(VLA-4, LFA-1, Mac-1)在過渡性CD8+ T細胞(C3簇)、末端效應CD8+ T細胞(C6, C11簇)和CD4 ctl (C13簇)中表現出較高的表達。其他細胞趨化因子、粘附分子及其受體，如CCL4、CCL5、CX3CR1、CD99和SELPLG，也在這些細胞毒性T細胞中廣泛且相對高表達。部分基因在PD患者中表達明顯上調。這些基因在白細胞跨內皮遷移通路中顯著富集(KEGG: hsa04670)，這可能代表了細胞毒性T細胞通過PD中血腦屏障的一種可能機制。