以往，研究人員通常利用RNA測序(xu)（RNA-seq）來檢(jian)測樣(yang)本(ben)中(zhong)的(de)所有RNA轉(zhuan)錄(lu)本(ben)，以發(fa)現新型RNA，或開展(zhan)基因表達分析。不過(guo)(guo)，測序(xu)的(de)對象往往是組織樣(yang)本(ben)或細(xi)胞(bao)群，這使(shi)得細(xi)胞(bao)之(zhi)間的(de)差(cha)異有可能(neng)被(bei)平(ping)均值所掩蓋。作為(wei)獨一無二(er)的(de)個(ge)體，細(xi)胞(bao)也許并不樂意自己的(de)光芒被(bei)掩蓋。于是，單細(xi)胞(bao)測序(xu)應運而生(sheng)。自2013年(nian)被(bei)《Nature Methods》評為(wei)年(nian)度技(ji)術以來，這項技(ji)術正被(bei)迅速(su)地采用，發(fa)表文(wen)獻的(de)數量也在(zai)逐(zhu)年(nian)遞增。單細(xi)胞(bao)RNA-seq（single-cell RNA sequencing）技(ji)術作為(wei)一項革(ge)命性(xing)工具，在(zai)單細(xi)胞(bao)水(shui)平(ping)上(shang)對轉(zhuan)錄(lu)組進(jin)行分析，已經被(bei)廣泛(fan)用于多個(ge)方面的(de)生(sheng)物醫(yi)學研究，包括(kuo)腫(zhong)瘤(liu)異質性(xing)研究、新細(xi)胞(bao)類型的(de)鑒定、組織發(fa)育與細(xi)胞(bao)分化過(guo)(guo)程研究和基因調控(kong)網絡研究等。

細(xi)(xi)胞(bao)外(wai)囊(nang)泡（EV）是細(xi)(xi)胞(bao)分泌的脂質(zhi)雙層膜結(jie)構的囊(nang)泡狀小(xiao)體(ti)(ti)，直徑約為(wei)50~1 000 nm。EV廣(guang)泛存在(zai)于細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)養上清(qing)液(ye)、血(xue)清(qing)、血(xue)漿、唾液(ye)、尿液(ye)、乳汁(zhi)等體(ti)(ti)液(ye)中，其攜(xie)帶蛋白質(zhi)、脂類(lei)、DNA、RNA，參與細(xi)(xi)胞(bao)間信(xin)號傳遞、物質(zhi)交換、免疫調節等。目前，EV被認為(wei)是疾病診斷中潛在(zai)的無創生物標(biao)志物和藥物傳遞載體(ti)(ti)。EV是內源性細(xi)(xi)胞(bao)產物，需要親代細(xi)(xi)胞(bao)來源才(cai)能獲得，因此EV存在(zai)高度(du)異質(zhi)性。

傳統的(de)(de)檢測(ce)EV貨物分(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)的(de)(de)方(fang)法（如PCR、RNA測(ce)序(xu)）通常借助于批量(liang)(liang)(liang)分(fen)(fen)析確定EV內(nei)物質(zhi)含量(liang)(liang)(liang)，但(dan)缺失了單個(ge)EV分(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)量(liang)(liang)(liang)和EV間異質(zhi)性的(de)(de)信(xin)息。即便是后來的(de)(de)數(shu)字PCR、結合(he)qPCR的(de)(de)流式細(xi)胞術等可以檢測(ce)單個(ge)EV的(de)(de)貨物分(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)量(liang)(liang)(liang)，但(dan)仍(reng)缺乏單個(ge)EV RNA圖譜。因(yin)此，在單個(ge)EV水平上(shang)探索轉錄(lu)組(zu)特征和異質(zhi)性至關重要。

單(dan)細(xi)胞(bao)RNA測(ce)序(xu)（scRNA-seq）技術使得能夠在(zai)單(dan)細(xi)胞(bao)水平檢(jian)測(ce)基因表達，以及檢(jian)測(ce)細(xi)胞(bao)異質性和細(xi)胞(bao)類型。在(zai)此基礎上(shang)，此篇旨(zhi)在(zai)建立一種實驗(yan)和分析方法來進行單(dan)細(xi)胞(bao)RNA測(ce)序(xu)以揭示單(dan)個EV的轉錄組(zu)特征。

單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao) RNA 測(ce)(ce)序(xu)（Single cell RNA sequencing，scRNA-seq）是一種(zhong)在(zai)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)水平(ping)上利(li)用 RNA 測(ce)(ce)序(xu)對(dui)特(te)定(ding)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)群體進行基(ji)因表達譜定(ding)量的高通量實驗技術。待(dai)測(ce)(ce)組織經過單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分(fen)離、RNA 提(ti)取、逆(ni)轉錄、文庫(ku)構建和測(ce)(ce)序(xu)，便可利(li)用數據分(fen)析獲得多個細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的基(ji)因表達譜。其技術原理主(zhu)要包括單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分(fen)離、擴增測(ce)(ce)序(xu)和數據分(fen)析3方面。

10×genomics技(ji)術：首先凝(ning)膠(jiao)微(wei)珠(zhu)(zhu)(zhu)上(shang)連接上(shang)特定的(de)(de)DNA片(pian)段(duan)，DNA片(pian)段(duan)由三部分(fen)(fen)組成：Barcode、UMI、PolyT組成。Barcode是(shi)(shi)由16個(ge)(ge)堿基(ji)組成。一(yi)共有(you)400萬(wan)種Barcode，一(yi)個(ge)(ge)微(wei)珠(zhu)(zhu)(zhu)是(shi)(shi)對應于一(yi)種Barcode，通(tong)過這400萬(wan)種Barcode，可以把凝(ning)膠(jiao)微(wei)珠(zhu)(zhu)(zhu)給(gei)區分(fen)(fen)開。UMI是(shi)(shi)一(yi)段(duan)隨機序(xu)(xu)列(lie)，也就(jiu)是(shi)(shi)說每一(yi)個(ge)(ge)DNA分(fen)(fen)子，都有(you)自(zi)(zi)己的(de)(de)UMI序(xu)(xu)列(lie)。10bp的(de)(de)UMI，有(you)100萬(wan)種序(xu)(xu)列(lie)的(de)(de)變化(hua)（4^10 = 1,048,576），UMI的(de)(de)作用(yong)是(shi)(shi)為了(le)區分(fen)(fen)哪些reads是(shi)(shi)來自(zi)(zi)于一(yi)個(ge)(ge)原始cDNA分(fen)(fen)子，區分(fen)(fen)基(ji)因片(pian)段(duan)重復(fu)還是(shi)(shi)duplication及(ji)區分(fen)(fen)是(shi)(shi)真(zhen)實的(de)(de)SNP位點還是(shi)(shi)PCR產(chan)生的(de)(de)突變。通(tong)過10×genomics儀器將單(dan)個(ge)(ge)細胞與單(dan)個(ge)(ge)凝(ning)膠(jiao)微(wei)珠(zhu)(zhu)(zhu)通(tong)過油相混(hun)在一(yi)起，形成油包(bao)水的(de)(de)小(xiao)微(wei)滴(di)(di)，接下來把細胞膜破(po)掉，讓細胞當(dang)中(zhong)的(de)(de)mRNA游(you)離出來。游(you)離出來的(de)(de)mRNA與小(xiao)液滴(di)(di)中(zhong)的(de)(de)水相混(hun)合，也就(jiu)是(shi)(shi)和(he)逆轉錄酶、結合在凝(ning)膠(jiao)微(wei)珠(zhu)(zhu)(zhu)上(shang)的(de)(de)核酸引物(wu)、以及(ji)dNTP底物(wu)相接觸，進行后(hou)去反(fan)應。

圖1 單細胞RNA測序技(ji)術原(yuan)理

文中(zhong)實驗選取人(ren)慢性髓系白血病(bing)細胞K562、人(ren)臍帶間充質干(gan)細胞MSC，并使用差(cha)速離(li)(li)心法從K562和(he)MSC培養液(ye)中(zhong)分離(li)(li)EVS。將分離(li)(li)出的EVS進(jin)行了鑒定(ding)；隨后有使用流(liu)式細胞術進(jin)行計數，之后再進(jin)行scRNA-seq。

首先采用差速離心(xin)法分離K562和(he)MSC細(xi)胞來源的(de)(de)(de)EVS。如圖(tu)(tu)2a所示，通(tong)過透射電鏡觀察到具有(you)膜結(jie)構(gou)的(de)(de)(de)球形囊泡(pao)。納(na)米(mi)粒(li)(li)(li)子跟(gen)蹤分析(xi)證(zheng)實EVS的(de)(de)(de)粒(li)(li)(li)徑分布為100-1000nm，大多數在(zai)(zai)100-200nm范圍內（圖(tu)(tu)2b)。通(tong)過EV進行標(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)標(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)，包括跨膜蛋(dan)白(bai)(bai)(CD9)、胞漿蛋(dan)白(bai)(bai)（Alix和(he)TSG101)和(he)微囊泡(pao)特異性(xing)標(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)蛋(dan)白(bai)(bai)Annexin A1（圖(tu)(tu)2 c)來驗證(zheng)EV的(de)(de)(de)有(you)效性(xing)。為了用流(liu)式細(xi)胞術測量EV濃度(du)，用100、300、500和(he)1000 nm的(de)(de)(de)校準珠確定(ding)EV門控策略（圖(tu)(tu)2d)，并(bing)通(tong)過鈣(gai)黃綠(lv)(lv)素-AM染色(se)來確定(ding)完整的(de)(de)(de)EV。鈣(gai)黃綠(lv)(lv)素-AM標(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)完整的(de)(de)(de)EV但不標(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)膜碎片(pian)或(huo)其他碎片(pian)。在(zai)(zai)P6點處記(ji)(ji)(ji)(ji)錄K562-EV和(he)MSC-EV樣本的(de)(de)(de)鈣(gai)黃綠(lv)(lv)素陽(yang)性(xing)事件(jian)濃度(du)（圖(tu)(tu)2 e，f)。EVS被定(ding)義(yi)為鈣(gai)黃綠(lv)(lv)素-AM陽(yang)性(xing)事件(jian)，直徑在(zai)(zai)100～1000納(na)米(mi)之間（命名為K562-EV1和(he)MSC-EV)。由于過濾磷酸鹽(yan)緩(huan)沖鹽(yan)水(PBS)中(zhong)的(de)(de)(de)顆(ke)(ke)粒(li)(li)(li)大多小于300納(na)米(mi)，這可(ke)能導致通(tong)過10x基(ji)因組學捕獲EVS的(de)(de)(de)概率(lv)下降，然后(hou)將大小為300-1000納(na)米(mi)的(de)(de)(de)鈣(gai)黃綠(lv)(lv)素-AM陽(yang)性(xing)顆(ke)(ke)粒(li)(li)(li)（命名為K562-EV2)作為對照（圖(tu)(tu)2e)。為了進一步證(zheng)明鈣(gai)黃綠(lv)(lv)素AM標(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)完整的(de)(de)(de)EVS，用Triton X-100洗滌(di)劑裂解(jie)EVS的(de)(de)(de)磷脂雙層。如圖(tu)(tu)2g所示，經過2%的(de)(de)(de)Triton X-100處理后(hou)，P6點的(de)(de)(de)事件(jian)率(lv)顯著降低，證(zheng)實這些事件(jian)是EVS而不是碎片(pian)。

圖2 分離的EVS的性質和濃度分析

為(wei)(wei)了探(tan)索(suo)單個(ge)(ge)(ge)(ge)EV的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄組(zu)學(xue)特征(zheng)，在(zai)10X基(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)學(xue)平(ping)臺上對(dui)3個(ge)(ge)(ge)(ge)EV樣(yang)(yang)本(ben)(K562-EV1、K562-EV2和(he)(he)(he)(he)(he)MSC-EV）進行(xing)了scRNA-seq檢(jian)(jian)測(ce)。如圖(tu)(tu)3a所示，在(zai)去(qu)(qu)除背(bei)景條形碼(ma)、識別(bie)(bie)異常(chang)值(zhi)和(he)(he)(he)(he)(he)去(qu)(qu)除雙(shuang)重值(zhi)后(hou)，使(shi)用三個(ge)(ge)(ge)(ge)原(yuan)始(shi)的(de)(de)(de)(de)10x基(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)輸(shu)出數(shu)(shu)(shu)據(ju)集進行(xing)下(xia)游分(fen)析。虛線下(xia)面表示每個(ge)(ge)(ge)(ge)數(shu)(shu)(shu)據(ju)集在(zai)每個(ge)(ge)(ge)(ge)步驟中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)處理的(de)(de)(de)(de)條形碼(ma)數(shu)(shu)(shu)。由(you)于(yu)EV通常(chang)比細胞小且含量較低，cell ranger算法(fa)無法(fa)區分(fen)EV和(he)(he)(he)(he)(he)背(bei)景（圖(tu)(tu)3b）。經過(guo)嘗(chang)試(shi)和(he)(he)(he)(he)(he)改進，使(shi)用具有(you)自適應(ying)閾值(zhi)的(de)(de)(de)(de)CB2算法(fa)可(ke)有(you)效區分(fen)真實的(de)(de)(de)(de)EV和(he)(he)(he)(he)(he)背(bei)景。在(zai)去(qu)(qu)除背(bei)景barcode后(hou)，三個(ge)(ge)(ge)(ge)樣(yang)(yang)本(ben)分(fen)別(bie)(bie)獲得了2366、4684和(he)(he)(he)(he)(he)1680個(ge)(ge)(ge)(ge)barcode，且拐點(dian)清晰（圖(tu)(tu)3c）。然后(hou)，設(she)置質控參數(shu)(shu)(shu)去(qu)(qu)除異常(chang)EV，并用DoubletFinder軟件去(qu)(qu)除潛在(zai)的(de)(de)(de)(de)doublets。最終，共獲得2088個(ge)(ge)(ge)(ge)K562-EV1、3935個(ge)(ge)(ge)(ge)K562-EV2和(he)(he)(he)(he)(he)1603個(ge)(ge)(ge)(ge)MSC-EV的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄組(zu)數(shu)(shu)(shu)據(ju)。其中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，在(zai)K562-EV1轉(zhuan)錄組(zu)數(shu)(shu)(shu)據(ju)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)檢(jian)(jian)測(ce)到3299個(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)(ji)因(yin)，在(zai)K562-EV2中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)檢(jian)(jian)測(ce)到5660個(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)(ji)因(yin)，在(zai)MSC-EV中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)檢(jian)(jian)測(ce)到2936個(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)(ji)因(yin)。K562-EV1和(he)(he)(he)(he)(he)MSC-EV數(shu)(shu)(shu)據(ju)集中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)每個(ge)(ge)(ge)(ge)EV的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)位數(shu)(shu)(shu)非常(chang)接(jie)近，分(fen)別(bie)(bie)為(wei)(wei)44.5和(he)(he)(he)(he)(he)42，且UMI計(ji)數(shu)(shu)(shu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)位數(shu)(shu)(shu)也(ye)相(xiang)似(si)，而K562-EV2的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)位數(shu)(shu)(shu)和(he)(he)(he)(he)(he)UMI計(ji)數(shu)(shu)(shu)略高些（圖(tu)(tu)3d）。之后(hou)，對(dui)MSC-EV和(he)(he)(he)(he)(he)MSC的(de)(de)(de)(de)單細胞數(shu)(shu)(shu)據(ju)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)檢(jian)(jian)測(ce)到的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)數(shu)(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)頻率分(fen)布(bu)進行(xing)比較，發現EVs的(de)(de)(de)(de)分(fen)布(bu)形狀(zhuang)類(lei)(lei)似(si)于(yu)細胞（圖(tu)(tu)3e）。在(zai)K562-EV1中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，每個(ge)(ge)(ge)(ge)EV檢(jian)(jian)測(ce)到的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)數(shu)(shu)(shu)范(fan)圍為(wei)(wei)6-97個(ge)(ge)(ge)(ge)，在(zai)K572-EV2中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)為(wei)(wei)11-148個(ge)(ge)(ge)(ge)，在(zai)MSC-EV中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)為(wei)(wei)7-90個(ge)(ge)(ge)(ge)，平(ping)均值(zhi)為(wei)(wei)52。同樣(yang)(yang)地，EV和(he)(he)(he)(he)(he)細胞中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)UMI計(ji)數(shu)(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)分(fen)布(bu)曲(qu)線也(ye)顯(xian)示了類(lei)(lei)似(si)的(de)(de)(de)(de)結果（圖(tu)(tu)3f）。在(zai)K562-EV1中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)每個(ge)(ge)(ge)(ge)EV的(de)(de)(de)(de)UMI計(ji)數(shu)(shu)(shu)范(fan)圍為(wei)(wei)19-102個(ge)(ge)(ge)(ge)，K562-EV2中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)為(wei)(wei)33-152個(ge)(ge)(ge)(ge)，MSC-EV為(wei)(wei)19-94個(ge)(ge)(ge)(ge)，平(ping)均數(shu)(shu)(shu)為(wei)(wei)66。

圖3 單個EV轉錄組的特征

接(jie)下(xia)來，研究者對(dui)3個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)EV數(shu)據(ju)(ju)集中的(de)(de)前500個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)高表(biao)(biao)達基(ji)(ji)因(yin)(yin)進行(xing)分析。三個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)EV樣本共有323個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)因(yin)(yin)，其中包括78個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)核糖(tang)體基(ji)(ji)因(yin)(yin)和8個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)線粒(li)體基(ji)(ji)因(yin)(yin)（圖4a）。另外(wai)，僅在K562-EV數(shu)據(ju)(ju)集中發(fa)現(xian)了5個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)血(xue)紅蛋(dan)白基(ji)(ji)因(yin)(yin)和4個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)線粒(li)體基(ji)(ji)因(yin)(yin)。為了驗(yan)證(zheng)單個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)EV數(shu)據(ju)(ju)集的(de)(de)可靠性，將單個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)EV和批量EV RNA測(ce)序數(shu)據(ju)(ju)中表(biao)(biao)達最高的(de)(de)前500個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)因(yin)(yin)進行(xing)比(bi)較。發(fa)現(xian)5個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)數(shu)據(ju)(ju)集中共有229個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)因(yin)(yin)高表(biao)(biao)達，包括76個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)核糖(tang)體基(ji)(ji)因(yin)(yin)和7個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)線粒(li)體基(ji)(ji)因(yin)(yin)（圖4b）。與單個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)EV結(jie)果(guo)一致(zhi)，5個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)血(xue)紅蛋(dan)白基(ji)(ji)因(yin)(yin)也在3個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)K562-EV數(shu)據(ju)(ju)集中被(bei)發(fa)現(xian)。這說明單個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)EV測(ce)序數(shu)據(ju)(ju)的(de)(de)可靠性。

此外，研(yan)究者還分(fen)析(xi)了每個數據集中(zhong)基(ji)(ji)(ji)(ji)因表(biao)達(da)(da)(da)百(bai)分(fen)比(bi)最(zui)高(gao)(gao)的前10個基(ji)(ji)(ji)(ji)因（圖4c）。HBG2在K562-EV1和(he)K562-EV2中(zhong)的表(biao)達(da)(da)(da)百(bai)分(fen)比(bi)最(zui)高(gao)(gao)，分(fen)別為(wei)41.9%和(he)49.8%。TMSB10在MSC-EV中(zhong)表(biao)達(da)(da)(da)百(bai)分(fen)比(bi)最(zui)高(gao)(gao)，為(wei)35.1%。EEF1A1在3個EV數據集中(zhong)均為(wei)高(gao)(gao)表(biao)達(da)(da)(da)基(ji)(ji)(ji)(ji)因，表(biao)達(da)(da)(da)百(bai)分(fen)比(bi)分(fen)別為(wei)38.2%、44.8%和(he)28%。然后，將上述篩選出來的20個基(ji)(ji)(ji)(ji)因比(bi)較分(fen)析(xi)，發現其中(zhong)18個基(ji)(ji)(ji)(ji)因是核糖體(ti)基(ji)(ji)(ji)(ji)因，EEF1A1和(he)FTL（鐵蛋白輕鏈）除外。

圖4 EV樣本中的高表達基因

為(wei)(wei)了(le)探索(suo)單個(ge)(ge)EV的(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄異質性(xing)，采用t-SNE和(he)無監(jian)督聚類(lei)分析(xi)單個(ge)(ge)EV測(ce)序數(shu)(shu)(shu)據(ju)。Harmony包用來整合(he)和(he)校正K562-EV1和(he)K562-EV2數(shu)(shu)(shu)據(ju)集(ji)上的(de)(de)(de)(de)(de)(de)批(pi)次效應，然后(hou)確定了(le)12個(ge)(ge)clusters，而在(zai)(zai)MSC-EV數(shu)(shu)(shu)據(ju)集(ji)中(zhong)確定了(le)10個(ge)(ge)clusters（圖(tu)5a-c）。同(tong)時，使用Seurat軟(ruan)件包中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)FindAllMarkers功能來表征每個(ge)(ge)EV cluster中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)標(biao)(biao)記基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)。在(zai)(zai)整合(he)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)K562-EV數(shu)(shu)(shu)據(ju)集(ji)中(zhong)，cluster 0的(de)(de)(de)(de)(de)(de)EV數(shu)(shu)(shu)占比(bi)最多，約(yue)為(wei)(wei)28.9%，但(dan)缺乏顯著(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)標(biao)(biao)記基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)；cluster 1檢(jian)測(ce)到1個(ge)(ge)核(he)糖體(ti)(ti)標(biao)(biao)記基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)，cluster 2有(you)2個(ge)(ge)核(he)糖體(ti)(ti)標(biao)(biao)記基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)；cluster 6和(he)cluster 11的(de)(de)(de)(de)(de)(de)標(biao)(biao)記基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)均為(wei)(wei)線粒(li)體(ti)(ti)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)，cluster 8的(de)(de)(de)(de)(de)(de)標(biao)(biao)記基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)都(dou)是(shi)(shi)血紅蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)（圖(tu)5d）。而在(zai)(zai)MSC-EV數(shu)(shu)(shu)據(ju)集(ji)中(zhong)，cluster 7的(de)(de)(de)(de)(de)(de)標(biao)(biao)記基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)是(shi)(shi)線粒(li)體(ti)(ti)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)（圖(tu)5e）；且(qie)與(yu)GO富(fu)集(ji)結果中(zhong)顯著(zhu)富(fu)集(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)骨架相關功能一致，存(cun)在(zai)(zai)多個(ge)(ge)細(xi)胞(bao)骨架基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)，如原肌球蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)（TPM1/2/4）、微管蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)（TUBB）等(deng)。比(bi)較K562-EV和(he)MSC-EV數(shu)(shu)(shu)據(ju)集(ji)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)cluster標(biao)(biao)記結果，除線粒(li)體(ti)(ti)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)和(he)核(he)糖體(ti)(ti)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)外，還存(cun)在(zai)(zai)2個(ge)(ge)重疊基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)，轉(zhuan)移相關肺腺癌轉(zhuan)錄物1（MALAT1）和(he)熱休克蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)90α家族A類(lei)成員1（HSP90AA1）。

圖5 單個EV的轉錄異質性

為了比較EV與其親本細胞(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)達，將單(dan)個(ge)EV數(shu)(shu)據(ju)(ju)(ju)集與親代細胞(bao)單(dan)細胞(bao)數(shu)(shu)據(ju)(ju)(ju)集整合(he)并進行分(fen)析。結(jie)果表(biao)明，每個(ge)cluster均存在(zai)EV和(he)細胞(bao)，說明不同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)EV來自(zi)不同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)細胞(bao)。在(zai)K562-EV1、K562-EV2和(he)K562這3個(ge)數(shu)(shu)據(ju)(ju)(ju)集中(zhong)，共確定(ding)了9個(ge)不同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)clusters（圖(tu)6a）。Cluster 6和(he)cluster 7的(de)(de)(de)(de)(de)數(shu)(shu)據(ju)(ju)(ju)大多數(shu)(shu)來自(zi)EV數(shu)(shu)據(ju)(ju)(ju)集，cluster 8的(de)(de)(de)(de)(de)的(de)(de)(de)(de)(de)數(shu)(shu)據(ju)(ju)(ju)主要來自(zi)K562細胞(bao)數(shu)(shu)據(ju)(ju)(ju)集（圖(tu)6b）。Cluster 1的(de)(de)(de)(de)(de)標記基(ji)因(yin)主要是血(xue)紅蛋白基(ji)因(yin)，而cluster 2的(de)(de)(de)(de)(de)標記基(ji)因(yin)是線粒體基(ji)因(yin)（圖(tu)6e）。此外(wai)，整合(he)MSC-EV和(he)MSC數(shu)(shu)據(ju)(ju)(ju)集確定(ding)了12個(ge)clusters（圖(tu)6c），單(dan)個(ge)EV分(fen)散在(zai)MSC中(zhong)（圖(tu)6c，d）。所有(you)clusters的(de)(de)(de)(de)(de)標記基(ji)因(yin)以散點圖(tu)展示(shi)，包括(kuo)許多細胞(bao)骨架基(ji)因(yin)，如(ru)TUBA1A/B/C和(he)TUBB4B和(he)肌動蛋白基(ji)因(yin)（ACTA2/G2）（圖(tu)6f）。

圖6 整合EV與親本細胞的團簇分布

scRNA-seq技術的(de)(de)(de)飛(fei)速(su)發展使人(ren)們對組織中細(xi)(xi)胞(bao)種類(lei)、細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)特(te)殊狀態有了深入認識。而scRNA-seq的(de)(de)(de)優勢是它能夠檢(jian)測出細(xi)(xi)胞(bao)之(zhi)間的(de)(de)(de)差異性(xing)，提高(gao)了基因(yin)表(biao)達(da)研究(jiu)的(de)(de)(de)分辨率， 因(yin)此它常被(bei)應用于以下幾個方面 ：探索組織中存在哪(na)些細(xi)(xi)胞(bao)類(lei)型(xing)或者亞群(qun)；識別未知或稀(xi)有的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)類(lei)型(xing)或狀態；闡述在細(xi)(xi)胞(bao)分化過程或者不同(tong)時間內基因(yin)表(biao)達(da)變(bian)化；檢(jian)測特(te)定細(xi)(xi)胞(bao)亞群(qun)的(de)(de)(de)差異表(biao)達(da)；通過表(biao)達(da)譜進(jin)行聚類(lei)，推斷基因(yin)調控網(wang)絡。

基于10x Genomics Chromium系(xi)統利用油包水(shui)的微反應體系(xi)，通(tong)(tong)過序列標簽區別群體中的不(bu)同細(xi)胞，獲得單細(xi)胞水(shui)平(ping)的數(shu)字化基因表(biao)達譜，可實現數(shu)千(qian)甚至數(shu)萬個單細(xi)胞群體分析，解(jie)決常(chang)規scRNA-seq方法在通(tong)(tong)量(liang)或擴展性方面存在的不(bu)足，為單細(xi)胞研究開拓新的思路。其主要優勢：超高通(tong)(tong)量(liang)；項目周(zhou)期短(duan)；細(xi)胞捕獲效率高；真正的單細(xi)胞測序；測序平(ping)臺(tai)兼容(rong)度廣。

然(ran)而，此篇作(zuo)者首(shou)次使用10x Genomics Chromium平臺和(he)(he)(he)改進的實(shi)驗和(he)(he)(he)生(sheng)物信息學分析(xi)方法對單個EV的基(ji)因表(biao)達進行高通量分析(xi)，揭示了K562和(he)(he)(he)MSC的單個EV RNA表(biao)達譜和(he)(he)(he)異質性。這種方法適用于所有類(lei)型的EV，為EV貨(huo)物分子及其分類(lei)提(ti)供了途徑。