2017-06-28
BSA（Bulk segregant analysis）稱為(wei)混(hun)合分組分析法，是近年來(lai)興起的一種(zhong)快速簡(jian)單的性(xing)(xing)狀(zhuang)定位的方法。廣(guang)泛運用于擬南芥、水(shui)稻、玉米(mi)、黃瓜(gua)等物種(zhong)上。BSA的特點之一就是將(jiang)兩(liang)種(zhong)極端性(xing)(xing)狀(zhuang)的子代個體(ti)混(hun)合測序（pool-seq）。但BSA絕對不是混(hun)池測序這么簡(jian)單，實(shi)際上根據群(qun)體(ti)材料、實(shi)驗設(she)計的不同(tong)，BSA又有各(ge)種(zhong)不同(tong)的方法。接下來(lai)就為(wei)大家(jia)一一介(jie)紹。
QTL-seq
QTL即數量性(xing)狀(zhuang)位點，在(zai)定位QTL時需要挑選兩個性(xing)狀(zhuang)差(cha)(cha)異較大(da)（抗病(bing)(bing)/感(gan)病(bing)(bing)、高桿(gan)/矮(ai)桿(gan)）的純合親(qin)本(ben)進(jin)行雜交，構建(jian)F2群(qun)體(ti)或RIL群(qun)體(ti)。由于研究(jiu)的數量性(xing)狀(zhuang)，子代表(biao)型不(bu)會非此即彼，而是(shi)在(zai)群(qun)體(ti)中呈連續的正(zheng)態分(fen)布。選擇(ze)表(biao)現出(chu)極端(duan)性(xing)狀(zhuang)的20~30個個體(ti)進(jin)行混池(chi)測序(xu)，比如極端(duan)感(gan)病(bing)(bing)和(he)極端(duan)抗病(bing)(bing)、最(zui)高和(he)最(zui)矮(ai)的個體(ti)。我們通常選擇(ze)要研究(jiu)的性(xing)狀(zhuang)的親(qin)本(ben)作(zuo)為參(can)考序(xu)列，將(jiang)混池(chi)測序(xu)的reads比對到參(can)考序(xu)列，計算SNP-Index。因(yin)為基因(yin)遺傳的隨機性(xing)，大(da)部分(fen)SNP-index會在(zai)0.5附近。但與(yu)所研究(jiu)性(xing)狀(zhuang)相關(guan)QTL區域，兩個混池(chi)間SNP-index差(cha)(cha)異會非常大(da)，通過這一原理我們可以將(jiang)性(xing)狀(zhuang)相關(guan)QTL大(da)致(zhi)定位到基因(yin)組上某(mou)一區域。
MutMap
當面對(dui)通(tong)過EMS誘變(bian)(bian)產生(sheng)(sheng)的(de)突(tu)(tu)變(bian)(bian)性(xing)狀時，我們采取了與QTL不同(tong)的(de)方(fang)(fang)法(fa)，稱之為MutMap即Mutation+Map。該方(fang)(fang)法(fa)先將突(tu)(tu)變(bian)(bian)體(ti)與野生(sheng)(sheng)型(xing)親本進(jin)行(xing)雜交，得到(dao)(dao)F1代。F1代再自交得到(dao)(dao)F2代，在F2代中選擇突(tu)(tu)變(bian)(bian)型(xing)個(ge)體(ti)進(jin)行(xing)混池測序(xu)。然后將測序(xu)得到(dao)(dao)的(de)reads比對(dui)到(dao)(dao)親本基因(yin)組(zu)上，計算SNP-index。由于突(tu)(tu)變(bian)(bian)體(ti)為純合個(ge)體(ti)，性(xing)狀相(xiang)關SNP-index應該為1，由于連鎖關系，相(xiang)鄰位(wei)(wei)點(dian)SNP-index也會增加。其余無(wu)關SNP位(wei)(wei)點(dian)的(de)SNP-index為0.5。因(yin)此SNP-index圖會出現(xian)一個(ge)峰值，性(xing)狀相(xiang)關候選基因(yin)就位(wei)(wei)于該區(qu)域內。Mutmap的(de)方(fang)(fang)法(fa)雜交時間短，相(xiang)對(dui)于QTL定位(wei)(wei)更(geng)加省(sheng)時高效；由于突(tu)(tu)變(bian)(bian)個(ge)體(ti)純合，背景更(geng)純，噪音少；只(zhi)用對(dui)突(tu)(tu)變(bian)(bian)體(ti)混池和(he)野生(sheng)(sheng)型(xing)親本進(jin)行(xing)測序(xu)，成本更(geng)低，分析更(geng)簡單。
Mutmap+
Mutmap在針對(dui)EMS誘導突(tu)變(bian)的(de)(de)(de)(de)性(xing)狀(zhuang)研(yan)究(jiu)中(zhong)優勢非常明顯，但并(bing)不(bu)是(shi)所有性(xing)狀(zhuang)都適合用Mutmap的(de)(de)(de)(de)方(fang)法(fa)。對(dui)于純(chun)合突(tu)變(bian)致死、不(bu)育或(huo)者嚴格自(zi)(zi)交且人工雜交困(kun)難(nan)的(de)(de)(de)(de)物種就無法(fa)使用Mutmap的(de)(de)(de)(de)方(fang)法(fa)進(jin)行研(yan)究(jiu)。莫慌！有新的(de)(de)(de)(de)方(fang)法(fa)可以(yi)應對(dui)，我們稱之為(wei)(wei)Mutmap+。該方(fang)法(fa)是(shi)將(jiang)EMS誘導產(chan)生的(de)(de)(de)(de)突(tu)變(bian)體(ti)(ti)(ti)M1自(zi)(zi)交產(chan)生M2，選(xuan)(xuan)擇M2中(zhong)含(han)有突(tu)變(bian)基因的(de)(de)(de)(de)野(ye)生型個(ge)體(ti)(ti)(ti)進(jin)行自(zi)(zi)交產(chan)生M3。M3發生性(xing)狀(zhuang)分離，選(xuan)(xuan)擇M3子代中(zhong)野(ye)生型和突(tu)變(bian)型各20株個(ge)體(ti)(ti)(ti)，混池測(ce)序。將(jiang)reads分別(bie)比對(dui)到親本的(de)(de)(de)(de)基因組上(shang)，計算(suan)SNP-index。由于M2許(xu)多突(tu)變(bian)位點(dian)已經純(chun)合，M3上(shang)很多區(qu)域SNP-index為(wei)(wei)1。但與(yu)突(tu)變(bian)位點(dian)相關的(de)(de)(de)(de)SNP-index為(wei)(wei)1是(shi)只有突(tu)變(bian)池才有的(de)(de)(de)(de)。所以(yi)計算(suan)△SNP-index，去除背景噪音，就可以(yi)找到突變所在基因(yin)區域，定位突變基因(yin)。
Mutmap-gap
對(dui)于以重測序為基(ji)(ji)(ji)(ji)礎的(de)(de)(de)分(fen)析內容(rong)，都需要有(you)參(can)考(kao)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組。但往往研究的(de)(de)(de)樣本(ben)與數據庫(ku)中的(de)(de)(de)參(can)考(kao)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組屬于不同品系，因(yin)(yin)(yin)此(ci)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組上存(cun)在(zai)一定的(de)(de)(de)差異。如果(guo)EMS誘導的(de)(de)(de)突變發生在(zai)一個參(can)考(kao)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組沒有(you)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)上，那(nei)么用上述的(de)(de)(de)MutMap和MutMap+就無法(fa)找出該候選(xuan)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)。而(er)MutMap-Gap的(de)(de)(de)方法(fa)就是(shi)結合了MutMap和de novo組裝的(de)(de)(de)一種基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)定位(wei)方法(fa)，從而(er)解決參(can)考(kao)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)缺失位(wei)點上的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)突變問(wen)題。
Mutmap-Gap首先(xian)將所(suo)研究品(pin)系的(de)(de)(de)野生型(xing)和(he)參(can)考(kao)基(ji)因(yin)組(zu)比對，得到(dao)所(suo)研究品(pin)系的(de)(de)(de)參(can)考(kao)基(ji)因(yin)組(zu)。然后利用EMS誘變(bian)(bian)，再(zai)進(jin)行(xing)MutMap分析(xi)，得到(dao)SNP-index圖(tu)。對位(wei)于SNP-index圖(tu)peak區域(yu)內的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)進(jin)行(xing)分析(xi)，如(ru)果在這個區域(yu)內找不到(dao)跟突變(bian)(bian)性狀相關(guan)的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)，那么突變(bian)(bian)位(wei)點很有可能就在品(pin)系特有基(ji)因(yin)區域(yu)內。這時候我們將之前(qian)比對不上參(can)考(kao)基(ji)因(yin)組(zu)的(de)(de)(de)野生型(xing)親(qin)本unmapped reads，和(he)位(wei)于這個peak區域(yu)的(de)(de)(de)野生型(xing)親(qin)本mapped reads一起(qi)進(jin)行(xing)de novo組(zu)裝，得到(dao)潛在的(de)(de)(de)新(xin)基(ji)因(yin)，再(zai)以此為(wei)參(can)考(kao)計算SNP-index。
總結：
這四種方法(fa)都是基(ji)于(yu)純(chun)合基(ji)因型(xing)(xing)親(qin)(qin)本(ben)(ben)的(de)(de)(de)，都是通(tong)過(guo)將雜交(jiao)家系中具有極(ji)(ji)端性狀(zhuang)個(ge)體混(hun)合測(ce)序(xu)(xu)，計算SNP-index，來實現(xian)基(ji)因定位。不同點在(zai)于(yu)需(xu)(xu)要測(ce)序(xu)(xu)的(de)(de)(de)樣(yang)本(ben)(ben)以及其適(shi)用范(fan)圍(wei)。QTL-seq需(xu)(xu)要測(ce)序(xu)(xu)的(de)(de)(de)為兩個(ge)親(qin)(qin)本(ben)(ben)和(he)(he)兩個(ge)極(ji)(ji)端性狀(zhuang)子(zi)代(dai)混(hun)池，適(shi)用于(yu)質量性狀(zhuang)、有明顯主效基(ji)因的(de)(de)(de)數量性狀(zhuang)；Mutmap需(xu)(xu)要測(ce)序(xu)(xu)的(de)(de)(de)樣(yang)本(ben)(ben)為突(tu)變(bian)(bian)型(xing)(xing)子(zi)代(dai)混(hun)池和(he)(he)野(ye)生(sheng)型(xing)(xing)親(qin)(qin)本(ben)(ben)，適(shi)用于(yu)誘變(bian)(bian)突(tu)變(bian)(bian)性狀(zhuang)；Mutpmap+需(xu)(xu)要測(ce)序(xu)(xu)的(de)(de)(de)樣(yang)本(ben)(ben)包(bao)括(kuo)野(ye)生(sheng)型(xing)(xing)親(qin)(qin)本(ben)(ben)、突(tu)變(bian)(bian)型(xing)(xing)子(zi)代(dai)池和(he)(he)野(ye)生(sheng)型(xing)(xing)子(zi)代(dai)池，適(shi)用于(yu)早(zao)期致死突(tu)變(bian)(bian)或無法(fa)異交(jiao)的(de)(de)(de)突(tu)變(bian)(bian)株；Mutmap-Gap適(shi)用于(yu)目標基(ji)因不在(zai)物種參考基(ji)因組上的(de)(de)(de)性狀(zhuang)。
但總(zong)的來講，相對于其他的性狀定位方法，利(li)用(yong)BSA技(ji)術進(jin)行性狀定位周期更(geng)短，價格更(geng)低(di)，定位效果更(geng)好(hao)。
參(can)考文獻(xian)
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[4] Takagi H1, Uemura A, Yaegashi H, Tamiru M, Abe A, Mitsuoka C, Utsushi H, Natsume et al. 2013. MutMap-Gap: whole-genome resequencing of mutant F2 progeny bulk combined with de novo assembly of gap regions identifies the rice blast resistance gene Pii.New phytologist New Phytologist 2013 200(1):276–283.
