2022-12-29
為(wei)(wei)了解決臨床上大多(duo)保存(cun)樣(yang)(yang)本(ben)類型FFPE樣(yang)(yang)本(ben)的(de)(de)(de)(de)(de)有效利用，10x Visium FFPE空(kong)(kong)(kong)間基(ji)因(yin)(yin)表(biao)達分(fen)(fen)析能夠(gou)突破以(yi)往用福爾馬林(lin)固定-石蠟包埋（FFPE）組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)切片(pian)(pian)進(jin)行(xing)空(kong)(kong)(kong)間基(ji)因(yin)(yin)表(biao)達分(fen)(fen)析存(cun)在的(de)(de)(de)(de)(de)障礙，釋(shi)放那些隱藏在樣(yang)(yang)本(ben)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)信息。Visium FFPE 空(kong)(kong)(kong)間基(ji)因(yin)(yin)表(biao)達分(fen)(fen)析作為(wei)(wei)一種突破性的(de)(de)(de)(de)(de)解決方(fang)案，將(jiang)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)學技術的(de)(de)(de)(de)(de)優勢與RNA測序的(de)(de)(de)(de)(de)高(gao)通(tong)量和(he)(he)發現能力(li)融入FFPE組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)樣(yang)(yang)本(ben)中(zhong)(zhong)，可(ke)對病(bing)理(li)學家主(zhu)導的(de)(de)(de)(de)(de)傳統(tong)分(fen)(fen)析進(jin)行(xing)補充。它能夠(gou)以(yi)高(gao)分(fen)(fen)辨(bian)率(lv)對整張組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)切片(pian)(pian)進(jin)行(xing)分(fen)(fen)析，從空(kong)(kong)(kong)間上分(fen)(fen)析人和(he)(he)小 鼠FFPE樣(yang)(yang)本(ben)中(zhong)(zhong)超(chao)過18,000個基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)RNA表(biao)達。通(tong)過全轉(zhuan)錄組(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)析以(yi)及適用于FFPE組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)分(fen)(fen)析的(de)(de)(de)(de)(de)專(zhuan)業試劑(ji)，您(nin)能夠(gou)檢(jian)測任(ren)何通(tong)路中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)任(ren)何基(ji)因(yin)(yin)，分(fen)(fen)辨(bian)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)異質(zhi)性，并在形態(tai)背景下揭示(shi)各種細胞類型和(he)(he)細胞狀態(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)空(kong)(kong)(kong)間分(fen)(fen)布。
技術亮點 ? 采(cai)用(yong)RNA模板連接（RTL）探針(zhen)組來確(que)保高靈敏(min)度和(he)高特(te)異(yi)性； ? 重新分析長(chang)期保存的生(sheng)物庫樣本以發(fa)現生(sheng)物標志物，或開(kai)展回顧性研究和縱向研究，在一段時間內(nei)追(zhui)蹤生(sheng)物過程(cheng)； ? 擺脫(tuo)只分(fen)析預先定義的目標范(fan)圍的限制，可分(fen)析整(zheng)張FFPE組織切片； ? 與免(mian)疫(yi)熒光相結合來(lai)觀(guan)察蛋白質和基因表達，或與H&E染色(se)相結合來(lai)觀(guan)察形(xing)態背景。 （來自10x官方(fang)資(zi)料(liao)）
技術原理 針(zhen)(zhen)對FFPE樣(yang)(yang)本(ben)的(de)(de)(de)(de)特(te)殊性(xing)，10x Visium目前針(zhen)(zhen)對小鼠和人的(de)(de)(de)(de)超過18,000個基因數據庫(ku)設計了探針(zhen)(zhen)，每一個基因都(dou)有(you)(you)一對probe以(yi)靶定(ding)RNA的(de)(de)(de)(de)特(te)定(ding)序(xu)列(lie)(lie)，LHS（左端(duan)(duan)探針(zhen)(zhen)）帶(dai)有(you)(you)read2序(xu)列(lie)(lie)，用(yong)以(yi)后(hou)續(xu)PCR擴(kuo)增，RHS（右端(duan)(duan)探針(zhen)(zhen)）帶(dai)有(you)(you)polyA序(xu)列(lie)(lie)，用(yong)以(yi)后(hou)續(xu)被玻片(pian)上(shang)的(de)(de)(de)(de)探針(zhen)(zhen)捕(bu)(bu)獲結合，通過probe與組織內(nei)RNA雜(za)交，將(jiang)RNA信(xin)息轉移到(dao)probe上(shang)，再將(jiang)探針(zhen)(zhen)兩端(duan)(duan)連接形成完整的(de)(de)(de)(de)DNA鏈(lian)(lian)。之(zhi)后(hou)降解雜(za)合RNA鏈(lian)(lian)，然后(hou)透化(hua)釋放連接的(de)(de)(de)(de)probe，完成信(xin)息捕(bu)(bu)獲過程（FFPE樣(yang)(yang)本(ben)不需要針(zhen)(zhen)對不同(tong)類型的(de)(de)(de)(de)樣(yang)(yang)本(ben)摸索透化(hua)條(tiao)件，所有(you)(you)的(de)(de)(de)(de)樣(yang)(yang)本(ben)類型都(dou)用(yong)同(tong)樣(yang)(yang)的(de)(de)(de)(de)透化(hua)條(tiao)件）。捕(bu)(bu)獲的(de)(de)(de)(de)probe在玻片(pian)上(shang)進行延(yan)伸反應，生(sheng)成cDNA，回收單鏈(lian)(lian)cDNA并構建測(ce)序(xu)文庫(ku)進行上(shang)機測(ce)序(xu)，從而(er)獲取基因表(biao)達信(xin)息。載玻片(pian)上(shang)的(de)(de)(de)(de)每個捕(bu)(bu)獲區域都(dou)有(you)(you)一個oligo陣(zhen)列(lie)(lie)，每條(tiao)oligo上(shang)包含(han)與probe結合的(de)(de)(de)(de)捕(bu)(bu)獲探針(zhen)(zhen)，該oligo同(tong)時具備描述空間信(xin)息的(de)(de)(de)(de)標記(ji)性(xing)序(xu)列(lie)(lie)。 FFPE樣(yang)本Visium空間(jian)轉錄組原理（來自(zi)10x官方資(zi)料）
實驗步驟 1、樣本質檢 由于10x visum的(de)芯片捕獲(huo)區域只能容(rong)納6.5*6.5的(de)組織大小(xiao)，因此建議FFPE樣(yang)(yang)本的(de)取(qu)材樣(yang)(yang)本大小(xiao)盡量不超過該面積（送石蠟包埋組織的(de)話，尤其(qi)注意），FFPE樣(yang)(yang)本的(de)厚度在5um-10um，切片建議是送15張左右(you)的(de)片子(zi)。 切(qie)片(pian)(pian)樣本先進行(xing)RNA質(zhi)量的(de)(de)檢測，一般是要(yao)求長度大(da)于(yu)200bp的(de)(de)RNA 片(pian)(pian)段(duan)占比能大(da)于(yu)50%，即DV200>50%。 Agilent RNA 6000 檢測結果展示（來自10x官方資料） RNA質(zhi)(zhi)量(liang)滿足(zu)質(zhi)(zhi)控要求后(hou)，對(dui)(dui)切(qie)片(pian)(pian)(pian)進(jin)行組(zu)織粘附性(xing)質(zhi)(zhi)檢(jian)也稱脫片(pian)(pian)(pian)質(zhi)(zhi)檢(jian)。脫片(pian)(pian)(pian)質(zhi)(zhi)檢(jian)的目的是保證正(zheng)式(shi)實驗(yan)樣本切(qie)片(pian)(pian)(pian)能牢固的粘附在玻片(pian)(pian)(pian)上(shang)，防止后(hou)續實驗(yan)過程中(zhong)加(jia)各種試劑(ji)或洗滌(di)浸水導致切(qie)片(pian)(pian)(pian)脫落。首先對(dui)(dui)切(qie)片(pian)(pian)(pian)進(jin)行脫蠟(la)，染色，復水，然后(hou)顯微(wei)成(cheng)像，以(yi)觀察切(qie)片(pian)(pian)(pian)的脫片(pian)(pian)(pian)情況。 組織粘附的定性評估（來自10x官方資料） 質檢合格后(hou)，將FFPE組織(zhi)切片(pian)(pian)放置(zhi)在空轉的(de)表(biao)達芯片(pian)(pian)上，并進行組織(zhi)學成像，H&E染色(se)觀察組織(zhi)的(de)形態學是否滿足正(zheng)式實(shi)驗(yan)(yan)(yan)需(xu)求。挑選符合需(xu)求的(de)正(zheng)式實(shi)驗(yan)(yan)(yan)樣本(ben)進行實(shi)驗(yan)(yan)(yan)。 2、正式實驗 確(que)認好具(ju)體(ti)的切片(pian)情況后，在正式玻片(pian)上進(jin)行(xing)貼片(pian)： 之(zhi)后進行探針雜(za)交，探針連接，組織(zhi)透(tou)化，探針延(yan)長，cDNA擴(kuo)增，文庫建庫，上機測序： FFPE樣本Visium空間轉錄組流程（來自10x官方資料）
數據分析比較 與適(shi)用于新鮮(xian)冷凍組織的Visium方案具有可比性: 比較結果發現(xian)，Visium FFPE 空間基(ji)因表(biao)達解決方(fang)案(an)是高(gao)度(du)靈敏、高(gao)特異性且可重(zhong)現(xian)的。（來自10x官方(fang)資料） A. Visium FFPE 空(kong)間數據與Visium 新鮮冷凍(dong)組織(zhi)數據表(biao)(biao)(biao)現出(chu)高(gao)(gao)度相關(guan)性，證(zheng)明了這兩種檢測的結果具有可(ke)比性，且具有高(gao)(gao)靈敏度。B. Hpca的空(kong)間mRNA表(biao)(biao)(biao)達數據證(zheng)明了其在新鮮冷凍(dong)以及(ji)FFPE樣本的海馬體中表(biao)(biao)(biao)達，并(bing)與已知的表(biao)(biao)(biao)達模(mo)式相吻合(he)，證(zheng)明了Visium FFPE 分析的特(te)異性。C. 取自小鼠腦(nao)組織(zhi)FFPE樣本并(bing)采(cai)用Visium FFPE空(kong)間分析處理的連續切片顯示出(chu)高(gao)(gao)的重復(fu)性，無論是檢測到的聚類還是總的唯一分子(zi)標識符（UMI）。 對兩(liang)年(nian)之(zhi)久的FFPE腫瘤樣本中約18,000個基因進行檢測： 檢測說明Visium FFPE 可以對長期保(bao)存的FFPE組(zu)織(zhi)樣本(ben)的全轉錄組(zu)進行分析，并(bing)具有完整(zheng)的組(zu)織(zhi)覆蓋度(du)。（來自10x官(guan)方資料(liao)） （A）H&E染色的(de)圖像；（B）Visium FFPE全(quan)轉錄(lu)組分(fen)析(xi)數據疊加到H&E染色結(jie)果上；（C）B結(jie)果的(de)點聚(ju)類(lei)分(fen)析(xi)。（D）三個(ge)關(guan)鍵的(de)乳腺癌(ai)基(ji)因的(de)表(biao)達水平和空間(jian)分(fen)布：ERBB2（HER2）、孕激素(su)受體(ti)(PGR）和雌(ci)激素(su)受體(ti)（ESR1）。
