2023-01-05
自單(dan)細(xi)胞(bao)測序面世以來(lai)，組學研究被推進到(dao)單(dan)細(xi)胞(bao)分辨率(lv)層次，一直是基礎(chu)科學研究領(ling)域的熱點。然(ran)而，想要做(zuo)單(dan)細(xi)胞(bao)的各位(wei)，是否遇到(dao)過(guo)以下問題:
?臨床樣本病(bing)理結(jie)果(guo)需要數天(tian)后才出(chu)，而單細胞要求樣本越新鮮越好(hao)，那對(dui)于病(bing)理暫不確定(ding)的樣本，做還是(shi)不做？
?大型隊(dui)列(lie)樣本取(qu)樣周(zhou)期長，不同批(pi)(pi)次(ci)實驗上機是否(fou)會有批(pi)(pi)次(ci)效應？
?樣本或細胞狀(zhuang)態脆弱，萬一(yi)在長距(ju)離運(yun)輸過(guo)程中失活了怎么辦?
?想捕捉細胞(bao)處理后的(de)短期快(kuai)速(su)變化，一些客觀(guan)原因又導致(zhi)無法進行(xing)上門實驗，那還能做單細胞(bao)測(ce)序嗎？
別著急，一(yi)款(kuan)新的產品Single Cell Fixed RNA Profiling Kit 完美(mei)解決(jue)以上所有問(wen)題(ti)！
Fixed RNA實驗原理
Fixed RNA Profiling是10x Genomics于今年新推出的一個產品，與3’單細胞轉錄組相比，其主要核心就是以4%的多聚甲醛（PFA）對細胞進行固定，可保存樣本的瞬時狀態，打破樣本的保存時限。由于樣本經過固定，所以10x不再用捕獲mRNA Ploy-A尾的方式進行單細胞mRNA的捕獲，而是針對人和小鼠的已知基因，設計了約18000種的探針對，其中低表達量的基因設計了包含三個探針對，高表達的的基因則設計了一個探針對。探針首先會和mRNA雜交，后續探針上的PCS1序列和beads上的partial Capture Sequence 1結合，從而引入10x barcode序列。除此之外，探針上攜帶的Probe Barcode還可以實現樣品間的條碼區分，支持1-16個樣的混樣測序。 圖1. 多聚甲醛固定(ding)細胞狀態 （圖片(pian)引用自10x Genomics官方材料） 圖2. Fixed RNA 探針結構示意圖 （圖片引用自10x Genomics官方材料） 圖3. Fixed RNA 探針和beads結構示意圖 （圖片引用自10x Genomics官方材料）
Fixed RNA工作流程
首先(xian)用4%的多聚甲醛（PFA）將樣本(ben)進(jin)行固定，然后(hou)(hou)進(jin)行探針雜(za)交(jiao)，雜(za)交(jiao)完(wan)成后(hou)(hou)進(jin)行建庫測序，最后(hou)(hou)用Cell Ranger進(jin)行分析。 圖4. Fixed RNA 實驗工作流程 （圖片引用自10x Genomics官方材料）
Fixed RNA數據展示
① 固定細胞的(de)存儲(chu)穩定性很好：對固(gu)定(ding)(ding)(ding)后立即(ji)運(yun)行(xing)（第(di)0天）、在4°C存(cun)(cun)(cun)儲(chu)一(yi)周或在-80°C存(cun)(cun)(cun)儲(chu)一(yi)個月的人類(lei)PBMC開展單(dan)細胞(bao)基因表達(da)分析。主要的細胞(bao)類(lei)型群(qun)體隨(sui)著時間的變化而保持穩定(ding)(ding)(ding)，表明PFA固(gu)定(ding)(ding)(ding)能夠(gou)鎖定(ding)(ding)(ding)生物學狀態，實現運(yun)輸和(he)存(cun)(cun)(cun)儲(chu)，從而緩(huan)解單(dan)細胞(bao)實驗的限制(zhi)。
圖5. 固定細胞的存儲穩定性 （圖片引用自10x Genomics官方材料） ② 固定樣本(ben)測序數據質量與3’單細(xi)胞(bao)基本(ben)一致：對不同(tong)的樣本類型(xing)分(fen)別(bie)進行了Fixed RNA和3’單細(xi)胞(bao)基(ji)因(yin)(yin)表達(da)分(fen)析(xi)，兩種方案(an)中(zhong)位基(ji)因(yin)(yin)基(ji)本一致甚至Fixed RNA的數據(ju)中(zhong)位基(ji)因(yin)(yin)要(yao)優于3’單細(xi)胞(bao)，這可能是(shi)因(yin)(yin)為探針(zhen)捕獲的靈敏度更(geng)高。 圖6. 對不同樣本類型分別進行Fixed RNA和3’單細胞基因表達分析 （圖片引用自10x Genomics官方材料） ③ 固(gu)定樣本混樣測序數據質(zhi)量(liang)影響(xiang)不大：對(dui)人類PBMC進(jin)(jin)行固定并(bing)分成16個(ge)(ge)樣(yang)(yang)本(ben)，每(mei)個(ge)(ge)樣(yang)(yang)本(ben)與(yu)一(yi)組帶條形(xing)碼的探針(zhen)進(jin)(jin)行雜交。將樣(yang)(yang)本(ben)混(hun)合，并(bing)放入Chromium X芯(xin)片的單(dan)個(ge)(ge)通道中運(yun)行。A. t-SNE圖(tu)顯示(shi)了(le)疊加(jia)在一(yi)起的所有混(hun)合物的80,000個(ge)(ge)細胞，而(er)不同(tong)的cluster代表(biao)了(le)每(mei)種細胞類型。B. t-SNE圖(tu)顯示(shi)了(le)按條形(xing)碼拆分相同(tong)數據(ju)，以(yi)證明不存在批次效應，而(er)且混(hun)樣(yang)(yang)分析(xi)是一(yi)種有效策略，可(ke)降低單(dan)細胞實驗的可(ke)變性，同(tong)時大(da)大(da)提高樣(yang)(yang)本(ben)通量。 圖7. 對固定樣本的基因表達數據開展細胞聚類分析 （圖片引用自10x Genomics官方材料）
Fixed RNA 技術優勢
打破樣本保存時限，病理分型樣本不再為難 組織和細胞懸液均可(ke)固定(ding)，固定(ding)后(hou)的樣本(ben)在4℃可(ke)儲(chu)存(cun)一周(zhou)，-20℃/-80℃最多可(ke)儲(chu)存(cun)3個月，允許確定(ding)好(hao)樣本(ben)病理情況再決定(ding)是否做單(dan)細胞。 解決珍貴和脆弱樣本的實驗限制 將樣本拓展到脆弱和珍貴細(xi)胞(bao)，不(bu)再擔心路途運輸導致細(xi)胞(bao)死(si)亡。 鎖定細胞狀(zhuang)態快速變(bian)化(hua)的瞬間，不再擔心外(wai)界壓力(li)導(dao)致細胞內(nei)部轉錄狀(zhuang)態的變(bian)化(hua)。 操作簡易且分析結果一致或優于3’單細胞 多聚甲醛(quan)固(gu)定樣本操作(zuo)簡單(dan)(dan)方便，最終數(shu)據與3’單(dan)(dan)細(xi)胞相差不(bu)大，某些低表達基因檢出率甚至優于3’單(dan)(dan)細(xi)胞。 支持混樣測序，降低實驗成本 一個孔內最多可(ke)以支持16個樣本混樣，單個樣本細(xi)胞(bao)數最多能到8000，對于(yu)細(xi)胞(bao)量不夠或樣本規模較大的項目，可(ke)大幅(fu)降低實驗成本。 降低批次效應 可以把不同時(shi)間(jian)取(qu)樣(yang)的(de)樣(yang)本實(shi)現(xian)同批(pi)次實(shi)驗(yan)上機測(ce)序(xu)分析，減(jian)少樣(yang)本批(pi)次效應。
Fixed RNA 送樣前Q&A 問：1.Fixed RNA送樣要求 答： 問：2.Fixed RNA適用物種和樣本類型： 答：因為Fixed RNA是基(ji)于探針(zhen)來捕獲mRNA，因此(ci)需要物種有對(dui)應的探針(zhen)集。目前Fixed RNA僅適用于人，小鼠后續會推出。樣本類型目前新鮮/冷凍組織、血液(ye)(ye)，細(xi)胞系(xi)、凍存細(xi)胞、細(xi)胞/核(he)懸液(ye)(ye)等均可適用。 問：3.樣本固定步驟可以自己進行嗎? 答：如果您(nin)需(xu)要自(zi)己(ji)固定(ding)(ding)我們(men)可以為您(nin)提(ti)供Fixed RNA 實(shi)驗(yan)方(fang)(fang)案(an)和(he)相關試劑；也可以選擇將樣本送至公司(si)，公司(si)解離(li)后進行固定(ding)(ding)步驟和(he)保存。由于(yu)公司(si)在實(shi)驗(yan)和(he)質檢判定(ding)(ding)方(fang)(fang)面(mian)經驗(yan)更豐富，建(jian)議(yi)是由公司(si)來(lai)進行解離(li)和(he)固定(ding)(ding)操作。 問：4.單細胞核測序和Fixed RNA都可以解決樣本保存難題，該如何選擇實驗方案？ 答：單細胞(bao)核測序(xu)適用(yong)某些受限于組織類(lei)型或保存方(fang)式無法做(zuo)單細胞(bao)測序(xu)的，比如： 1）細胞(bao)(bao)直徑過大或形(xing)狀不規則，如(ru)神(shen)經元(yuan)細胞(bao)(bao)、心(xin)肌細胞(bao)(bao)等，只能做抽核； 2）組織樣本已冷凍保存； Fixed RNA 適用(yong)于要做(zuo)單細胞，但是(shi)又遇到以下情況(kuang)的： 1）需要等病理(li)結果(guo)出來才能確定該例樣本是(shi)否滿足入組(zu)條件； 2）細(xi)胞狀態(tai)變(bian)(bian)化(hua)較(jiao)快(kuai)，關注某一確定時間點(dian)細(xi)胞內轉錄變(bian)(bian)化(hua)的； 3）樣(yang)本(ben)或細胞比較(jiao)脆(cui)弱(ruo)，易降解(jie)，無法承受(shou)長途(tu)運輸又不方便進行上(shang)門實驗(yan)； 4）擔(dan)心不同批次(ci)(ci)實驗可能導致的批次(ci)(ci)效應或想要降低(di)實驗成本
