2023-04-05
近年來，高(gao)通量(liang)(liang)測(ce)(ce)序技(ji)術一(yi)直被廣(guang)泛應用于(yu)微生物群落組成和(he)功能的(de)(de)研究(jiu)中(zhong)。然而，在(zai)進行(xing)微生物的(de)(de)定量(liang)(liang)分析時卻面臨了(le)一(yi)些困難。由(you)于(yu)擴增(zeng)效率、核酸提取(qu)和(he)測(ce)(ce)序深度等多(duo)種因素的(de)(de)影響，傳統的(de)(de)擴增(zeng)子(zi)測(ce)(ce)序所得(de)到的(de)(de)只是細菌的(de)(de)相對(dui)豐(feng)度信息，無(wu)法準(zhun)確地獲得(de)樣品中(zhong)各種細菌的(de)(de)絕對(dui)數量(liang)(liang)。
傳統的(de)(de)qPCR技術(shu)(shu)存在一些(xie)局限(xian)性(xing)，特別是對于復(fu)(fu)雜的(de)(de)樣(yang)本(ben)類型(xing)來說(shuo)。由于引物(wu)限(xian)制和重復(fu)(fu)性(xing)等原因，傳統的(de)(de)qPCR技術(shu)(shu)無(wu)法(fa)可(ke)靠(kao)地適用于微生(sheng)物(wu)多樣(yang)性(xing)豐富(fu)的(de)(de)樣(yang)本(ben)中(zhong)。此(ci)外，在qPCR技術(shu)(shu)中(zhong)引物(wu)的(de)(de)設計和優(you)化是一個非常繁瑣和費時的(de)(de)過(guo)程(cheng)，如果(guo)設計不當，甚至可(ke)能導致實驗結果(guo)的(de)(de)錯(cuo)誤或不準確。
為了解決這個難題，派森諾推出了16S絕對定量擴增子測序技術。該技術利用特有的人工合成內標，將16S擴增子測序技術與qPCR絕對定量技術合二為一，充分發揮16S擴增子適用范圍廣的優勢，避免由于PCR效率及建庫方法不同等因素引起的偏差，提高了數據的準確性和可比性。一次測序，便能獲得樣本中各細菌的豐度和絕對拷貝數等信息。
實驗流程介紹
16S絕對定量(liang)擴(kuo)增(zeng)子技術基于(yu)正(zheng)常擴(kuo)增(zeng)子測序(xu)流程，在樣(yang)品DNA中加入(ru)已(yi)知拷貝數的內(nei)標序(xu)列（12～15種），這些內(nei)標是自然界(jie)不存在的人工合成(cheng)DNA片(pian)段(duan)(duan)，長度(du)與16S rRNA基因片(pian)段(duan)(duan)相似，可被16S rRNA常規(gui)V區引(yin)物(wu)如V3V4、V4V5等區域引(yin)物(wu)擴(kuo)增(zeng)。在PCR擴(kuo)增(zeng)階段(duan)(duan)，內(nei)標序(xu)列與目(mu)標16S rRNA基因共同擴(kuo)增(zeng)，構成(cheng)混合的擴(kuo)增(zeng)產(chan)物(wu)。隨后進行文庫制備(bei)和測序(xu)，得到大量(liang)的tags序(xu)列信(xin)息(xi)。 通過計(ji)算(suan)每個內(nei)標理論拷貝(bei)數(shu)與(yu)測序(xu)中檢(jian)測到的(de)實(shi)際(ji)tags數(shu)之(zhi)間的(de)比例，繪(hui)制(zhi)出標準(zhun)曲線。該曲線展(zhan)示了內(nei)標已知拷貝(bei)數(shu)與(yu)測序(xu)tags數(shu)之(zhi)間的(de)關(guan)系，是校正樣品中細菌絕對豐度的(de)關(guan)鍵。標準(zhun)曲線可以用于計(ji)算(suan)每個樣品中不同OTUs/ASVs的(de)絕對拷貝(bei)數(shu)，即真實(shi)菌群(qun)(qun)數(shu)量，從而精確(que)地反(fan)映出微(wei)生(sheng)物群(qun)(qun)落的(de)組成和豐度。 圖1：技術路線圖
實測數據結果：
常規16S擴增子測序 VS 16S絕對定量擴增子測序 圖2所示(shi)：為(wei)兩種(zhong)技(ji)術手段獲得的前20種(zhong)屬水平(ping)細(xi)菌群(qun)落相對(dui)豐度；其中Sample1/2為(wei)常規16S擴增子測(ce)序(xu)所獲得的結(jie)(jie)果(guo)，Samlpe1/2-添加內標為(wei)16S絕對(dui)定量擴增子測(ce)序(xu)所獲得結(jie)(jie)果(guo)。從(cong)數據分(fen)析結(jie)(jie)果(guo)可以看出，兩者數據分(fen)析結(jie)(jie)果(guo)基(ji)(ji)本保持(chi)一致，種(zhong)群(qun)豐度及(ji)構成無明顯變化，說明添加內標基(ji)(ji)本不會影響樣本的群(qun)落組(zu)成。 圖2 圖(tu)(tu)3/4所(suo)示(shi)(shi)：圖(tu)(tu)3為(wei)常規16S擴增(zeng)子測(ce)序所(suo)獲得(de)的(de)最(zui)終數(shu)據結果(guo)；圖(tu)(tu)4為(wei)16S絕對定(ding)量(liang)擴增(zeng)子測(ce)序所(suo)獲得(de)的(de)最(zui)終數(shu)據結果(guo)；從(cong)圖(tu)(tu)3與圖(tu)(tu)4的(de)顯示(shi)(shi)的(de)結果(guo)來看(kan)，16S絕對定(ding)量(liang)擴增(zeng)子測(ce)序能(neng)夠更加直觀并真實還原樣本本身的(de)細菌含量(liang)。 圖3 圖4
主要優勢
??相比于qPCR絕(jue)對定(ding)量技術，16S絕(jue)對定(ding)量擴增子測序技術實操更加簡便，具(ju)有更高的(de)通(tong)量和更廣泛的(de)應用范圍。 傳統qPCR定量(liang)技術需要設(she)計(ji)特(te)定的引(yin)物(wu)和探針，多(duo)數只能檢測特(te)定的微生物(wu)，并且在低(di)通量(liang)平臺上運行，一次只能分析少量(liang)的樣品，存(cun)在限制。 相比之下，16S絕對定量擴增子(zi)測序(xu)技術使用(yong)的(de)是通用(yong)引物(wu)(wu)，避(bi)免了由于引物(wu)(wu)和(he)探針的(de)特異性(xing)和(he)擴增偏好(hao)性(xing)不同帶來的(de)偏差，只需要對樣本進行DNA提取、PCR擴增和(he)建(jian)庫測序(xu)等(deng)簡(jian)單操作(zuo)即可獲(huo)得樣本中所有細菌的(de)種類和(he)準確數(shu)量，從而更全面地(di)了解環境微(wei)生物(wu)(wu)群落的(de)組成和(he)結構(gou)。 ??與常規16S擴(kuo)(kuo)增子測序(xu)(xu)技術相比，16S絕對定量擴(kuo)(kuo)增子測序(xu)(xu)技術可(ke)以盡可(ke)能(neng)消除PCR擴(kuo)(kuo)增以及測序(xu)(xu)等(deng)因素對樣本內細菌群落的定量分析的影響。 常(chang)規(gui)16S擴增子技術只能根據序列信息推斷得出微(wei)生(sheng)物的種類和相對豐(feng)度，并(bing)不能直(zhi)接反映微(wei)生(sheng)物在(zai)樣本中(zhong)的實際存(cun)在(zai)數量，需要通過外部標準(zhun)曲(qu)線或其他方(fang)法(fa)將(jiang)相對豐(feng)度轉換為(wei)絕對豐(feng)度。 16S絕對定(ding)量擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子測序技術(shu)會針對每一(yi)個(ge)樣本(ben)(ben)繪制相(xiang)應的標準曲線，從而得(de)到樣本(ben)(ben)中微生(sheng)物(wu)的準確數(shu)量，避免(mian)了由于PCR擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)效(xiao)率、測序深度和數(shu)據(ju)處理等因(yin)素引起的偏差。如圖3/4所示，使用(yong)傳統16S擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)子技術(shu)得(de)到的微生(sheng)物(wu)相(xiang)對豐度看起來一(yi)致，但其實(shi)真實(shi)含量相(xiang)差了幾倍。 ??16S絕對定(ding)量(liang)擴增子技(ji)術可以真實還原樣本內細(xi)菌群落的確切含量(liang)，為科研(yan)提供更(geng)加精準的數據參考； 相比于(yu)傳統(tong)的(de)定(ding)量(liang)方法，如菌(jun)落計(ji)數等，16S絕對定(ding)量(liang)擴增(zeng)子(zi)測序技術具(ju)有更(geng)高的(de)精(jing)度和靈敏度，依據實驗每個(ge)環(huan)節的(de)具(ju)體(ti)參數，逐級還原初始(shi)生物學樣本(ben)內(nei)細(xi)菌(jun)群落的(de)確切含量(liang)。
主要應用
16S絕(jue)對定量(liang)擴(kuo)增(zeng)子測序能夠更好地溯源樣本內微生(sheng)物群落的真(zhen)實情況，因此其應用的方向也會相比常規檢測手段更加寬泛（如圖(tu)5所示(shi)）。 圖5 總之，16S絕(jue)對(dui)定量(liang)擴(kuo)增子測(ce)(ce)序技(ji)術是一種非(fei)常(chang)有前景的技(ji)術手(shou)段。與其他(ta)相關技(ji)術相比，16S絕(jue)對(dui)定量(liang)擴(kuo)增子技(ji)術具(ju)有操作簡便、獲取信息多、準確(que)性高(gao)等優點。在保持擴(kuo)增子測(ce)(ce)序檢測(ce)(ce)范圍優勢的同時(shi)，能夠真實(shi)還原樣(yang)本(ben)內細菌群(qun)(qun)落的確(que)切含量(liang)，為(wei)探究微生(sheng)物(wu)群(qun)(qun)落組(zu)成及其在不同環(huan)境下的變化等研究提供更加準確(que)的數據(ju)參考(kao)，對(dui)于研究微生(sheng)物(wu)群(qun)(qun)落的生(sheng)態學特征和(he)變化規律具(ju)有重(zhong)要的意(yi)義。
