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單細胞項目懸浮液制備寶典

2023-06-29

前言

隨著(zhu)這幾年單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)項目在(zai)科研臨(lin)床各個領域得到(dao)廣泛應(ying)用(yong)，派森(sen)諾生物單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)團隊積攢了大量不同(tong)樣本類(lei)型的(de)(de)單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)懸液(ye)(ye)制備(bei)經驗(yan)(yan)。單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)懸液(ye)(ye)質量的(de)(de)好壞(huai)是實(shi)(shi)驗(yan)(yan)成功與否的(de)(de)關鍵(jian)，然而一(yi)切實(shi)(shi)驗(yan)(yan)成功的(de)(de)源頭，都是基于對(dui)細(xi)胞(bao)狀態(tai)的(de)(de)判斷，所以了解(jie)自己(ji)的(de)(de)細(xi)胞(bao)特點及高質量細(xi)胞(bao)懸浮液(ye)(ye)的(de)(de)制備(bei)是重中(zhong)之重。

單細胞(bao)懸浮液上機(ji)前(qian)細胞(bao)質量(liang)要求如下：

細胞(bao)濃度:700-1200cells/ul

細胞總量：> 1 * 10⁵ cells

細胞直徑(jing)：5 – 40um

細胞活(huo)率：≥80%

細胞背(bei)景：無組織碎片或其他顆粒物

單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)懸液制(zhi)(zhi)(zhi)備(bei)(bei)(bei)的(de)(de)(de)(de)具體方案因樣本(ben)類(lei)型而異，根據自(zi)身(shen)實驗的(de)(de)(de)(de)需要，我們需要從(cong)各類(lei)樣本(ben)中(zhong)制(zhi)(zhi)(zhi)備(bei)(bei)(bei)單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)懸液，例如血液樣本(ben)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)PBMC;腹水；腦脊液；臨床癌變(bian)組(zu)織(zhi)樣本(ben)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)；動物組(zu)織(zhi)模型的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)；單核誘(you)導貼壁后形成(cheng)的(de)(de)(de)(de)巨(ju)噬細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、樹突狀(zhuang)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)；培(pei)養(yang)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)團(tuan)、類(lei)器官、細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系(xi)；懸浮(fu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)等等。成(cheng)功制(zhi)(zhi)(zhi)備(bei)(bei)(bei)高質(zhi)量的(de)(de)(de)(de)單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)懸液才是(shi)關鍵，下(xia)面就給(gei)大家詳細(xi)(xi)(xi)介紹從(cong)多種(zhong)樣本(ben)中(zhong)制(zhi)(zhi)(zhi)備(bei)(bei)(bei)單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)懸液的(de)(de)(de)(de)主要方法：

一：外周血單核細胞

全血制備PBMC（peripheral blood mononuclear cell）外周單個(ge)核細(xi)胞(bao)(bao)，其主要細(xi)胞(bao)(bao)類型為血液中具(ju)有(you)單個(ge)核的細(xi)胞(bao)(bao)，主要包括淋(lin)巴(ba)細(xi)胞(bao)(bao)（T細(xi)胞(bao)(bao)、B細(xi)胞(bao)(bao)），單核細(xi)胞(bao)(bao)，吞噬細(xi)胞(bao)(bao)，樹突狀細(xi)胞(bao)(bao)和其他少量細(xi)胞(bao)(bao)類型，其中淋(lin)巴(ba)細(xi)胞(bao)(bao)占很大一(yi)部分。

PBMC的(de)(de)制備采用密度梯度離(li)心(xin)(xin)法：取2ml新鮮血液樣本，與DPBS 1:1稀(xi)釋(shi)(shi)，混勻后用無菌吸管(guan)吸取稀(xi)釋(shi)(shi)后的(de)(de)血液，沿管(guan)壁緩(huan)慢加(jia)入至人淋巴細(xi)(xi)胞(bao)分離(li)液液面(mian)上。將離(li)心(xin)(xin)管(guan)緩(huan)緩(huan)地(di)不要晃蕩，保持界(jie)面(mian)清(qing)晰，放入水平離(li)心(xin)(xin)機(ji)， 500g，4℃離(li)心(xin)(xin) 25min，緩(huan)升緩(huan)降，離(li)心(xin)(xin)完畢后，小心(xin)(xin)取出(chu) 15 mL 試管(guan)，離(li)心(xin)(xin)后管(guan)內可分為三層(ceng)(ceng)，在上、中(zhong)層(ceng)(ceng)界(jie)面(mian)處有一層(ceng)(ceng)以單個核細(xi)(xi)胞(bao)為主的(de)(de)白色云霧(wu)層(ceng)(ceng)狹窄帶，即為我們所需要的(de)(de)單個核細(xi)(xi)胞(bao)。用無菌吸管(guan)吸取白色云霧(wu)層(ceng)(ceng)狹窄帶的(de)(de)單個核細(xi)(xi)胞(bao)，并置(zhi)于另一 15 mL 離(li)心(xin)(xin)管(guan)中(zhong)，清(qing)洗后加(jia)入紅細(xi)(xi)胞(bao)裂(lie)解液，室(shi)溫靜置(zhi)裂(lie)解 2min，800rpm 離(li)心(xin)(xin) 5min，再次清(qing)洗兩遍，重懸細(xi)(xi)胞(bao)，進行(xing)細(xi)(xi)胞(bao)計數和活力測定，吸取適量體積細(xi)(xi)胞(bao)懸液進行(xing)后續實驗。

二：哺乳動物組織樣本

傳統組(zu)織處理方法

研(yan)磨(mo)法

適(shi)用(yong)樣本類(lei)型：脾臟(zang)、胸腺(xian)、淋巴結

實驗步驟：

1、先將組織沖洗干凈，剪成(cheng)1-2mm大小；

2、放入研缽器中，攪(jiao)動研磨(mo)棒，使組織成勻漿狀態；

3、加入10mlDMEM至(zhi)器皿中沖洗收集細胞懸(xuan)浮液；

4、過70um細胞(bao)篩，4℃1500rpm離心5min；

5、棄上清，沉淀加(jia)入紅細(xi)胞裂解液，室溫3min，再過(guo)40um細(xi)胞篩；

6、加入(ru)等體積DMEM中(zhong)止裂紅后，4℃1500rpm 離心5min，棄上清；

7、用DMEM洗滌(di)一次，在重(zhong)懸細胞，計數后即可(ke)投入后續實驗。

酶解法

適(shi)用(yong)樣本(ben)類型：腫瘤、肝臟(zang)、腎臟(zang)、心(xin)臟(zang)、肺、胃(wei)腸(chang)道、腦、皮膚、骨

酶的種類選擇：

實驗步驟：

1、提前打開 37℃水浴鍋，提前準備好(hao)冰盒；提前配制不含(han) Ca2+、Mg2+的 PBS（含(han) 2%FBS），并且(qie)預冷。

2、配制(zhi)解離液，混勻，待完全溶解后(hou)，0.22um 濾(lv)膜濾(lv)過消毒待用。

3、取組織(zhi)樣(yang)本，用預冷的(de) DPBS 沖(chong)洗，低速離心(xin)。

4、將(jiang)收集的組織轉移至(zhi)裝有 5mL解離(li)液的 15mL 離(li)心管中(zhong)，將(jiang)此離(li)心管置于 37℃水浴(yu)中(zhong)震蕩(dang)消化 45 min，如沒有震蕩(dang)水浴(yu)鍋可用手(shou)搖代(dai)替。

5、將消(xiao)化后的(de)(de)溶液(ye)轉移至 40um 的(de)(de)細胞篩，收集通過的(de)(de)細胞濾液(ye)至一新的(de)(de)無菌(jun)離心管中。

6、4℃ 1000 rpm 離(li)心 10 min，棄(qi)上清。向細胞沉淀中加入 10mL 不含 Ca2+、Mg2+的(de)DPBS（含2%FBS）重懸細胞，1000 rpm 離(li)心 10 min，棄(qi)上清。

7、加(jia)入(ru) 10mL 不含(han) Ca2+、Mg2+的(de) PBS（含(han) 2%FBS）重懸細胞(bao)，并(bing)計數。

8、棄去上清，加(jia)入 200 uL DPBS+2%FBS 重懸細(xi)(xi)胞，進行細(xi)(xi)胞計數(shu)和活力測定，吸取適量(liang)體積細(xi)(xi)胞懸液(ye)進行后續(xu)實驗(yan)。

三：植物樣本原生質體制備

適用樣本類型：幼(you)嫩根、莖、葉，果(guo)(guo)實，種(zhong)子，瓜果(guo)(guo)

實驗步驟：

1、收(shou)集植物(wu)(wu)樣本：選擇適(shi)當(dang)的植物(wu)(wu)材料，如(ru)嫩葉(xie)、幼莖(jing)或懸浮細胞等(deng)，以獲取含有較高原生質體含量的組織。

2、細胞裂解：

a. 樣本(ben)預處理(li)：將植物材料洗(xi)凈(jing)，并(bing)剪碎成(cheng)小塊或研磨成(cheng)細胞懸(xuan)浮液。

b. 細胞(bao)裂解(jie)緩沖液：準備適(shi)當的細胞(bao)裂解(jie)緩沖液，可以(yi)包括一(yi)些重(zhong)要成分如Tris-HCl、NaCl、EDTA等，以(yi)維持細胞(bao)內部(bu)環境穩定。

c. 裂解(jie)方法：

??高(gao)壓破碎法：將細(xi)胞(bao)(bao)懸浮液(ye)經(jing)過高(gao)壓處理，使細(xi)胞(bao)(bao)破碎。需要注(zhu)意調控(kong)破碎壓力和(he)時(shi)間(jian)。

??化學裂解(jie)法：添加適當的化學裂解(jie)劑(ji)，如酶(mei)(mei)解(jie)酶(mei)(mei)、有機溶劑(ji)或(huo)表面活(huo)性(xing)劑(ji)等，來破壞細(xi)胞膜和細(xi)胞壁。

3、離心步驟(zou)：

a. 低(di)速(su)離(li)心(xin)：使(shi)用低(di)速(su)離(li)心(xin)將細(xi)胞(bao)殘渣、細(xi)胞(bao)核和大(da)碎片(pian)沉淀下來，得(de)到上清液。

b. 高(gao)速(su)差速(su)離(li)心(xin)：通(tong)過高(gao)速(su)離(li)心(xin)，將原(yuan)生質體從其他細(xi)胞器和碎(sui)片分(fen)離(li)出(chu)來(lai)。可以使用不同的離(li)心(xin)盛(sheng)裝，如離(li)心(xin)管(guan)或密度(du)梯度(du)離(li)心(xin)管(guan)。

4、懸浮和純化：

a. 上(shang)清液(ye)取樣：取出上(shang)清液(ye)中富含原(yuan)生(sheng)質體的上(shang)清部分，將其轉(zhuan)移至新的離心管中。

b. 洗滌：通過加(jia)入適當的緩沖液，可(ke)以進行一定次數的洗滌步驟，去除雜質和污(wu)染物。

c. 純(chun)化：使用(yong)密度(du)梯度(du)離心等技術，進一步純(chun)化原生質體樣品，以去除其他細胞器(qi)殘留。

四：植物樣本抽核

適用樣本類型：幼(you)嫩根、莖、葉，果(guo)實(shi)，種子，瓜果(guo)

實驗步驟：

1、收集植物樣本：選擇適當(dang)的植物材料，如嫩葉、幼莖或懸浮細(xi)胞等(deng)，以獲(huo)取含(han)有較高原生質體含(han)量的組織。

2、樣本研磨

準(zhun)備(bei)已消毒的研缽(bo)、研杵、藥(yao)匙，并用液(ye)氮(dan)預冷(leng)(leng)。將葉片(pian)樣本(ben)置于預冷(leng)(leng)研缽(bo)中(zhong)，加(jia)入(ru)(ru)液(ye)氮(dan)適當研磨為顆粒狀(zhuang)后(hou)，用預冷(leng)(leng)藥(yao)匙將粉末加(jia)入(ru)(ru)含有NIB緩沖液(ye)管中(zhong)勻(yun)漿(jiang)1-3次，勻(yun)漿(jiang)后(hou)放冰上靜(jing)置。

3、裂解過篩

取50ml管(guan)(guan)放(fang)置于冰上預冷，取適當孔徑大小篩網放(fang)于50ml管(guan)(guan)口。取步驟2中靜置勻(yun)漿管(guan)(guan)，將(jiang)懸液過(guo)篩，收集濾液至新(xin)2ml離(li)心(xin)管(guan)(guan)內，加(jia)入LB，混勻(yun)后孵育5～20min，離(li)心(xin)。

4、離心富集

離心后可觀察到(dao)白色(se)沉(chen)淀(dian)，在不干擾沉(chen)淀(dian)基礎上盡量棄凈上清，向沉(chen)淀(dian)中加入NIB-wash重懸，取50ml管(guan)預冷，取適當孔徑大小篩網放置(zhi)于管(guan)口(kou)，將懸液(ye)過(guo)篩，收集濾液(ye)。

5、純化除雜

將步驟4得到的濾液疊加(jia)至(zhi)percoll層上，進行密度(du)梯度(du)離(li)心；（若正疊加(jia)難以(yi)控(kong)制出(chu)現(xian)分層，可(ke)選擇先將濾液加(jia)入至(zhi)干凈2ml離(li)心管中(zhong)，槍頭吸取percoll后直(zhi)接插入管底(di)緩慢打出(chu)液體）。

6、收集核層：

離心(xin)后可(ke)見兩層液體中(zhong)間存在分層，即為細(xi)胞核層。收集核層至新(xin)2ml離心(xin)管，加入NIB-wash稀釋(shi)，離心(xin)。

7、重懸計數：

離心后棄上清(qing)保留沉(chen)(chen)淀(dian)（若無明顯沉(chen)(chen)淀(dian)可棄上清(qing)時殘留10ul），加入NB溶液(ye)進行(xing)重懸，AO/PI染色進行(xing)鏡檢。

派森諾單細胞團隊成功制備細胞懸浮液樣本類型匯總：