2023-07-06
一、前 言
單細(xi)胞測序(xu)文庫(ku)從Raw Data到Deduplicated Reads，其實是一(yi)個non-trivial的(de)流(liu)程。從fastq文件(jian)下(xia)機開始(shi)，不同來源的(de)Reads需經過層層計算和篩選，最終(zhong)只有少(shao)部分(fen)Reads能保留在表達矩陣（或counts table）中。這里用一(yi)張(zhang)圖總(zong)結(jie)，以幫(bang)助我們更好地(di)理(li)解單細(xi)胞文庫(ku)的(de)建庫(ku)和上游(you)分(fen)析(xi)（Upstream Analysis）。
二、示意說明
流(liu)程圖讀(du)(du)法：從(cong)下(xia)往上讀(du)(du)，不(bu)同(tong)顏色代表(biao)不(bu)同(tong)分析階(jie)段的(de)Reads；畫斜條紋陰影的(de)線(xian)段表(biao)示當(dang)前步驟到下(xia)一步中被清除掉的(de)Reads。 黑色：Total Input Reads，一般我用的(de)是(shi)測序(xu)下(xia)機后(hou)(hou)的(de)Clean Reads（公(gong)司給的(de)QC質控(kong)后(hou)(hou)的(de)Cleandata） 黑色->紫色：umi_tools whitelist, wash_whitelist, umi_tools extract 黑色陰影(ying)：Reads with Non-correctable Reads, invalid Barcode & UMI (discarded) 紫(zi)色：Barcode有效的Reads（Reads with valid Barcode & UMI） 紫色(se)->黃色(se)：STAR 紫(zi)色陰影：Reads NOT Unique Mapped to Genome (discarded) 黃色：Unique Mapped Reads，在10X中也叫Confidently Mapped Reads（Unique Mapped, valid Barcode & UMI Reads） 黃色->綠色(se)：featureCounts 黃(huang)色(se)陰影：Unique Mapped, valid Barcode & UMI but NOT assigned to feature 綠色：Effective Reads，即Unique Mapped, valid Barcode & UMI, feature assigned Reads 綠(lv)色->藍色：umi_tools count 藍色陰影：Reads Collapsed due to UMI deduplication 藍色：Deduplicated Reads，即最(zui)終用于生成表達矩(ju)陣的對Reads計數的結(jie)果 有了這張圖，我們可以做一個簡(jian)單(dan)直(zhi)觀的(de)推論：如果想(xiang)提(ti)高單(dan)細胞測序的(de)技術質量，則必須盡可能減少(shao)陰影部(bu)分的(de)Reads在(zai)總文庫中的(de)比例。
三、指導下游分析
仔細思考實驗流程，會發現每個陰影部分會受不同因素的影響。 黑色陰影(ying)：主(zhu)要影響(xiang)因素(su)之一是Barcode & UMI序列質量，即TSO引物質量；也有可能受(shou)TSO concatamer、RNA降解因素(su)影響(xiang) 紫色(se)陰影：主(zhu)要影(ying)響(xiang)因素是樣本制備質(zhi)量(liang)，即(ji)細胞(bao)活率(lv)、異源RNA污染等 黃(huang)色陰(yin)影：主要影響因素是生物學(xue)樣本內非mRNA成分的比例，如premRNA等，可能與樣本本身生物學(xue)性質有關 藍色陰影(ying)：主要與擴增循(xun)(xun)環數(shu)有(you)關，該部分Reads過多可能是因為擴增循(xun)(xun)環數(shu)過高 “降低(di)陰影部分比(bi)例(li)”可以作為(wei)單細胞(bao)測(ce)序實驗的(de)一項指導原則(ze)，幫助我們(men)進行實驗條件(jian)的(de)摸(mo)索，也可以作為(wei)單細胞(bao)技(ji)術(shu)開(kai)發(fa)的(de)一項指導原則(ze)，幫助我們(men)迭代優化試劑組(zu)成。
