2023-08-03
前言
眼(yan)睛、一(yi)個美麗而神(shen)奇的器(qi)官。
人(ren)類眼(yan)睛內部的(de)(de)眼(yan)球(qiu)近似球(qiu)狀(zhuang)，由(you)眼(yan)球(qiu)壁(bi)和眼(yan)內容物(wu)構(gou)成。人(ren)的(de)(de)眼(yan)球(qiu)壁(bi)由(you)外至內依(yi)次為纖維膜、血管膜、視網膜。角膜作為眼(yan)球(qiu)壁(bi)組(zu)成部分，是(shi)彎(wan)曲度大于眼(yan)球(qiu)外壁(bi)其他(ta)部分的(de)(de)透明圓盤狀(zhuang)結構(gou)；正常人(ren)角膜中央薄（約(yue)0.5mm）周邊厚（約(yue)1.0mm）；角膜由(you)無血管的(de)(de)結締組(zu)織構(gou)成；含(han)有豐富的(de)(de)神經(jing)末(mo)梢。
一、眼角膜結構簡介
人的(de)角(jiao)膜(mo)分(fen)為(wei)五(wu)層(ceng)，由前向后(hou)依次為(wei)：角(jiao)膜(mo)上皮(corneal epithelium)、前界層(ceng)(anterior limiting lamina )、角(jiao)膜(mo)基(ji)質（corneal stroma）、后(hou)界層(ceng)( posterior limiting lamina )、角(jiao)膜(mo)內皮(corneal endothelium)。
由于角膜(mo)的特殊(shu)構成，在(zai)解(jie)離過程(cheng)中(zhong)會出現細胞(bao)量較少且(qie)脆弱容(rong)易凋亡的情況(kuang)。經(jing)過測試優化，小(xiao)派提供(gong)一種高效、穩(wen)定的角膜(mo)組織解(jie)離方案，可獲得活(huo)性好、總(zong)量多、背景干凈的單細胞(bao)懸液。
二、解離方案
1、提(ti)前配(pei)制(zhi)復合酶解離(li)液（含木瓜蛋(dan)白酶、DNase Ⅰ等）及蛋(dan)白酶抑(yi)制(zhi)劑。
2、從組織保(bao)存液中取(qu)出角膜組織樣(yang)本，放入預冷的 DPBS中清洗。
3、將清洗后的(de)組(zu)織放(fang)到復合酶(mei)解離液(ye)中(zhong)，用眼科(ke)剪將組(zu)織剪成碎片(pian)狀(zhuang)，轉移至(zhi)含有(you)剩余解離液(ye)的(de)50ml離心管(guan)中(zhong)，置于37℃水浴(yu)中(zhong)震蕩消(xiao)化 30-90 min，期間可使用巴氏吸管(guan)輕(qing)柔吹打組(zu)織，使其充分接觸解離液(ye)。
4、消化結束后，解離液通過 40um 細(xi)(xi)胞篩進行過濾，收集通過的(de)細(xi)(xi)胞濾液至(zhi)一(yi)新的(de)無菌離心管中。
5、4℃，300 xg 離(li)(li)心 5 min，棄上清。向細胞沉(chen)淀(dian)中加入含蛋白酶(mei)抑制(zhi)劑和DNaseⅠ的培養基(ji)重(zhong)懸細胞，再通過低(di)速離(li)(li)心，獲得(de)背景干(gan)凈的細胞。
6、加(jia)入適量(liang)DPBS（含 2%FBS）重懸(xuan)細胞(bao)，取20uL細胞(bao)懸(xuan)液進行細胞(bao)計數(shu)和活力測定。（注：AOPI熒光計數(shu)、臺盼(pan)藍染色鏡(jing)檢(jian)）
三、結果展示
角膜(mo)組織
（注(zhu)：新鮮組織(zhi)短(duan)時間(jian)內取出，盡快放入(ru)到(dao)組織(zhi)保存液，送到(dao)實驗(yan)室）
鏡檢(jian)結果
單細(xi)胞(bao)(bao)懸(xuan)液背景干(gan)凈，細(xi)胞(bao)(bao)狀(zhuang)態(tai)好
活性、濃度檢測
細胞(bao)活性95%，濃(nong)度655個/ul，總量在(zai)15W以上(shang)。
數據質控
上圖是下機數(shu)(shu)據cellranger質控結果(guo)，細胞(bao)捕獲數(shu)(shu)及基(ji)因(yin)數(shu)(shu)都(dou)符(fu)合前期需求(qiu)。
