2023-09-06
前言
酶聯免疫吸(xi)附(fu)分析方法（enzyme linked immunosorbent assay ，ELISA ）是20世(shi)(shi)紀70年代(dai)初期由(you)荷(he)蘭學者 Weeman 與(yu)(yu) Schurrs 和瑞典學者 Engvall 與(yu)(yu) Perlman幾(ji)乎(hu)同(tong)時提出的(de)。它的(de)提出及發展是２０世(shi)(shi)紀以(yi)來在生物分析化學領域所取得(de)的(de)最偉(wei)大的(de)成就之(zhi)一 。
ELISA檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)是一(yi)種免(mian)疫檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)方(fang)法，通常(chang)用(yong)于(yu)測(ce)(ce)(ce)量(liang)(liang)生物樣品中的(de)(de)抗(kang)體(ti)或(huo)抗(kang)原(yuan)，包括蛋白質或(huo)糖蛋白。像其(qi)他免(mian)疫檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)法一(yi)樣，它(ta)們依靠抗(kang)體(ti)與目標的(de)(de)結合來(lai)促(cu)進檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)。Elisa具(ju)有(you)特異性強 、靈敏度高(gao) 、方(fang)法簡(jian)捷 、分析(xi)容(rong)量(liang)(liang)大 、檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)成(cheng)本低等(deng)優(you)點(dian) ，一(yi)般不(bu)需要貴重儀(yi)器(qi) ，可簡(jian)化(hua)(hua)或(huo)省去(qu)前處理步驟 ，并且可以提(ti)供系(xi)列商業(ye)化(hua)(hua)的(de)(de)技(ji)術產(chan)品 ，具(ju)有(you)常(chang)規理化(hua)(hua)分析(xi)技(ji)術無可比擬(ni)的(de)(de)選擇性和很高(gao)的(de)(de)靈敏度 ，非常(chang)適宜于(yu)復雜(za)基質中特定組分的(de)(de)分析(xi) 。目前 ，ELISA 快速檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)試劑盒 、試紙條等(deng)已得(de)到廣泛應用(yong)。
技術原理
ELISA 技術基于抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)或(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)固(gu)相(xiang)化及抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)或(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)酶(mei)標記。將抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)或(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)結合(he)(he)在固(gu)相(xiang)載體(ti)(ti)(ti)表(biao)面并保持其免疫(yi)學活性(xing)(xing)，此(ci)(ci)外將抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)或(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)進行酶(mei)標記，使其既保留其免疫(yi)學活性(xing)(xing)，又保留酶(mei)的(de)(de)(de)活性(xing)(xing)。在測定(ding)(ding)時，待(dai)測樣(yang)品（含有要檢(jian)測含量(liang)的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)或(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)）與(yu)(yu)(yu)固(gu)相(xiang)載體(ti)(ti)(ti)表(biao)面的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)或(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)發(fa)生抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)反(fan)應(ying)，特異性(xing)(xing)結合(he)(he)形成復(fu)(fu)合(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)。之后通過洗(xi)滌(di)的(de)(de)(de)方法使固(gu)相(xiang)載體(ti)(ti)(ti)上(shang)形成的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)復(fu)(fu)合(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)與(yu)(yu)(yu)液(ye)體(ti)(ti)(ti)中未反(fan)應(ying)的(de)(de)(de)其他物(wu)(wu)(wu)(wu)質分(fen)離(li)。再加入酶(mei)標記的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)或(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)，通過抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)反(fan)應(ying)而結合(he)(he)在固(gu)相(xiang)載體(ti)(ti)(ti)上(shang)。此(ci)(ci)時固(gu)相(xiang)上(shang)的(de)(de)(de)含酶(mei)量(liang)與(yu)(yu)(yu)樣(yang)品中待(dai)檢(jian)物(wu)(wu)(wu)(wu)質的(de)(de)(de)量(liang)呈正比。加入酶(mei)反(fan)應(ying)的(de)(de)(de)底(di)物(wu)(wu)(wu)(wu)后，底(di)物(wu)(wu)(wu)(wu)被酶(mei)催化成為(wei)有色產(chan)物(wu)(wu)(wu)(wu)，產(chan)物(wu)(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)量(liang)與(yu)(yu)(yu)樣(yang)品中待(dai)檢(jian)物(wu)(wu)(wu)(wu)質的(de)(de)(de)量(liang)直接相(xiang)關，故可根據呈色的(de)(de)(de)深淺(qian)進行定(ding)(ding)性(xing)(xing)或(huo)(huo)(huo)定(ding)(ding)量(liang)分(fen)析。由于酶(mei)的(de)(de)(de)催化效率很高，間接地放(fang)大了(le)免疫(yi)反(fan)應(ying)的(de)(de)(de)結果(guo)，使測定(ding)(ding)方法達到很高的(de)(de)(de)敏感度。
方法分類
Elisa包括雙抗體夾心法(fa) 、直(zhi)接(jie)法(fa)、間接(jie)法(fa) 、競爭法(fa) 、捕獲法(fa)等 。
1、直接法(direct ELISA)
將抗原(yuan)直(zhi)接固定(ding)在固相載體上，加入酶標(biao)記的(de)一(yi)級抗體，即可測定(ding)抗原(yuan)總量，此(ci)一(yi)級抗體的(de)特(te)異性非常重要。
優勢：操(cao)作(zuo)手續簡短(duan)，因(yin)無須使(shi)用二抗可避免(mian)交互反應。
缺點(dian)：試驗中的一(yi)抗都得用(yong)酶標記，但不是每(mei)種抗體都適(shi)合做標記，費用(yong)相對提高(gao)。
2、間接法(indirect ELISA)
此測(ce)定方法(fa)與直接法(fa)類(lei)似，差(cha)別在于一級(ji)抗體沒(mei)有(you)酶標記，改用酶標記的二級(ji)抗體去(qu)辨識一級(ji)抗體來測(ce)定抗原(yuan)量(liang)。
優(you)勢：二抗可以加強信號，而(er)且有多(duo)種(zhong)選擇能(neng)做不同的(de)(de)測(ce)定分析。不加酶標記的(de)(de)一級抗體則能(neng)保留它更多(duo)的(de)(de)免疫(yi)反應性(xing)。
缺點：交互反應發生的機率(lv)較(jiao)高(gao)。
3、雙抗體夾心法(sandwich ELISA)
被檢測的(de)抗(kang)(kang)原包(bao)被在兩個抗(kang)(kang)體之(zhi)間，其中一個抗(kang)(kang)體將抗(kang)(kang)原固定(ding)(ding)于固相(xiang)載(zai)體上，即(ji)捕(bu)捉抗(kang)(kang)體。另一個則是檢測抗(kang)(kang)體，此抗(kang)(kang)體可用酶標記(ji)(ji)后直接測定(ding)(ding)抗(kang)(kang)原的(de)量；或不標記(ji)(ji)，再(zai)透過酶標記(ji)(ji)的(de)二級抗(kang)(kang)體來(lai)測定(ding)(ding)抗(kang)(kang)原的(de)量。這兩種抗(kang)(kang)體必須小心選取(qu)，才(cai)可避(bi)免交互反應或競爭相(xiang)同的(de)抗(kang)(kang)原結合部位。
優勢：高靈敏、高專一性，抗原(yuan)無須事先純化。
缺點：抗原(yuan)一定得擁有(you)兩個以上的抗體結合部位。
4、競爭法(competitive ELISA)
樣(yang)本里的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(自由抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan))和純化并固(gu)(gu)定(ding)在固(gu)(gu)相載體(ti)(ti)(ti)上(shang)的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(固(gu)(gu)定(ding)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan))一(yi)起競爭相同的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)，當樣(yang)品里的(de)(de)自由抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)越(yue)多，就可以(yi)結(jie)合越(yue)多的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)，而固(gu)(gu)定(ding)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)就只能(neng)結(jie)合到較少的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)，反之亦然。經清洗(xi)步驟，洗(xi)去自由抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)和抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)復(fu)合物，只留(liu)下固(gu)(gu)定(ding)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)和抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)復(fu)合物，拿來與只有固(gu)(gu)定(ding)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)對照組結(jie)果相比較，根(gen)據(ju)呈色差異就可計算出樣(yang)品里的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)含量(liang)。
優勢：可適用比較(jiao)不純的(de)樣本，而(er)且數據再現(xian)性很高。
缺點：整體的敏感(gan)性和專一性都較差。
5、新ELISA技術：基于細胞法(cell-based ELISA)
是一(yi)種新的定性(xing)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)檢測技術，將(jiang)細(xi)(xi)胞(bao)直接在微孔板(ban)里(li)培(pei)養，待檢測時，不需(xu)抽提蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)和裂(lie)解細(xi)(xi)胞(bao)，便可直接測量微孔板(ban)里(li)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)經刺激或(huo)抑制(zhi)作用后(hou)的變化。
優(you)勢：無需裂(lie)解細(xi)(xi)胞，所(suo)以目標蛋白損失*少，可測(ce)定完整(zheng)細(xi)(xi)胞、黏附細(xi)(xi)胞、還有非(fei)粘附細(xi)(xi)胞。
缺點：不能(neng)測定抗原量。
在目前的生(sheng)物學研(yan)究(jiu)以(yi)及臨床診斷等領域(yu) ，雙抗體夾(jia)心法(fa)及競爭(zheng)法(fa)占(zhan)到免疫分析(xi)的 ８５％ 以(yi)上(shang) 。
實驗流程
1、準備試劑、樣品和標準品
2、加入準備好的樣品和標準品，37℃反應30分鐘
3、洗板5次，加入酶標試劑，37℃反應30分鐘
4、洗板5次，加入顯色液A、B 37℃顯色10分鐘
5、加入終止液
6、15分鐘內讀OD值
7、計算目標含量
Elisa實(shi)驗流程
通過標(biao)準品(pin)蛋白(bai)含量與OD值(zhi)的關(guan)系(xi)，制作標(biao)準曲線。
將樣(yang)本所測(ce)OD值代入標準曲(qu)線，即(ji)可(ke)求得樣(yang)本所含(han)對應蛋白(bai)的(de)含(han)量。
結果展示
原始讀數（OD值）
標準曲線分析
樣本實際蛋白濃度計算（ng/ml）
ELISA檢測的應用
1、疾病診斷
包(bao)括針對人類免(mian)疫缺陷(xian)病(bing)毒(du)（HIV）的快速抗體篩選測試，COIVD-19病(bing)毒(du)以(yi)及其他病(bing)毒(du)，細菌(jun)，真菌(jun)感(gan)染等，都可以(yi)通過(guo)Elisa測定進(jin)行疾病(bing)診斷。
2、食物過敏原的檢測
過敏(min)原如(ru)果被受影響(xiang)的(de)人攝入，可(ke)能是致(zhi)命(ming)的(de)，所以對于食(shi)品來說，宣布(bu)不(bu)含某些(xie)過敏(min)原，如(ru)花(hua)生[20]，是至(zhi)關重要(yao)的(de)。ELISA為(wei)此提供了極好的(de)靈敏(min)度，在某些(xie)情況下可(ke)低至(zhi)百(bai)萬(wan)分之(zhi)一(yi)（ppm），并且能夠(gou)應對一(yi)些(xie)食(shi)品類型，如(ru)油和(he)奶，而其他(ta)方法如(ru)PCR則難以應對。
3、生物制藥檢測
隨著生物(wu)仿制藥(yao)的(de)(de)發(fa)展，有必要證明(ming)它們與(yu)它們要模仿參考(kao)藥(yao)物(wu)之間的(de)(de)相似性。在這里(li)，ELISA也發(fa)揮了在確定(ding)藥(yao)物(wu)總(zong)濃度和檢測(ce)雜質等(deng)因素方面的(de)(de)效(xiao)用(yong)。
4、癌癥生物標志物測試
癌(ai)癥生(sheng)物標志物通常可以在血液樣(yang)本中檢測出來(lai)。因此，ELISA測試可以作為一種(zhong)非(fei)侵(qin)入性的方法，用(yong)來(lai)測定和量(liang)化已知的生(sheng)物標志物。
5、法醫藥物檢測
ELISA檢測可被毒理學家(jia)用于篩選(xuan)法醫樣(yang)(yang)品中的(de)濫用藥物痕跡，包括安非他命、可卡因、鴉片制劑(ji)、美(mei)沙酮、苯并二氮雜卓和大(da)麻素。雖然液體樣(yang)(yang)品，如尿液或血液比較容易(yi)處理，但也可以對固體樣(yang)(yang)品，如頭發(fa)，進行ELISA分(fen)析。
6、懷孕測試
人絨毛膜促(cu)性(xing)腺激(ji)素(su)（hCG）是懷孕時產生的一(yi)種激(ji)素(su)，可以通過ELISA在尿液樣品中檢測。
7、自身免疫性疾病
指示自(zi)身免疫性疾(ji)病的標志(zhi)物，如類(lei)風濕性關節炎和紅斑狼瘡，可通過ELISA測定和定量。
8、實驗室和臨床研究的檢測
對于實(shi)驗和(he)臨床研究中樣(yang)本中的各種抗原(yuan)抗體，可(ke)通過ELISA測(ce)定和(he)定量。
目前的(de)Elisa檢(jian)測可以同時進行大量(liang)(liang)樣品(pin)的(de)檢(jian)測，并(bing)可在酶標儀上迅速讀出結(jie)果。快(kuai)速、高(gao)效(xiao)、性價比(bi)高(gao)、結(jie)果準(zhun)確，想要(yao)測定血(xue)清(qing)、血(xue)漿、尿(niao)液、細胞、組織(zhi)等(deng)(deng)樣本中抗原抗體含量(liang)(liang)的(de)小伙(huo)伴(ban)們還在等(deng)(deng)什么(me)呢？心動不如(ru)行動！
基因工程產品目錄(lu)
