2023-09-21
前言
自單(dan)細胞(bao)測序技術開(kai)發以來，已經(jing)廣泛應用(yong)于(yu)腫瘤、神經(jing)、免(mian)疫學(xue)等醫學(xue)領域(yu)，在植物領域(yu)的應用(yong)也(ye)如雨后春(chun)筍逐(zhu)漸展開(kai)。下面是小(xiao)編(bian)整理(li)的植物單(dan)細胞(bao)文(wen)獻。 表1：植物單細胞測序文獻（不完全統計）
通過整理已(yi)發表(biao)的(de)植(zhi)物單(dan)細(xi)胞測(ce)(ce)序(xu)文(wen)章來看，主(zhu)要(yao)集(ji)(ji)中于模(mo)式植(zhi)物，如擬南芥、水稻、玉(yu)米(mi)、番茄、楊樹等(deng)，且主(zhu)要(yao)結(jie)果(guo)集(ji)(ji)中在細(xi)胞圖(tu)譜的(de)繪(hui)制(zhi)，包(bao)(bao)括(kuo)鑒定植(zhi)物組織中細(xi)胞類型(xing)、細(xi)胞基(ji)(ji)因表(biao)達情(qing)況，以(yi)及進一步(bu)利用擬時序(xu)軟(ruan)件闡述細(xi)胞的(de)分化發育過程(cheng)和描述該過程(cheng)中的(de)關鍵(jian)基(ji)(ji)因和通路(lu)，還有部分文(wen)獻(xian)研究逆境生物脅迫下的(de)轉(zhuan)錄(lu)(lu)響應，包(bao)(bao)括(kuo)細(xi)胞類型(xing)差異，基(ji)(ji)因表(biao)達和通路(lu)富集(ji)(ji)差異。涉及到技術包(bao)(bao)括(kuo)單(dan)細(xi)胞轉(zhuan)錄(lu)(lu)組測(ce)(ce)序(xu)，單(dan)細(xi)胞核轉(zhuan)錄(lu)(lu)組測(ce)(ce)序(xu)，空間轉(zhuan)錄(lu)(lu)組測(ce)(ce)序(xu)，單(dan)細(xi)胞ATAC測(ce)(ce)序(xu)等(deng)。 圖1&2：植物單細胞測序研(yan)究現(xian)狀 （數據來源：網絡文獻整理，截至2023.09） 根據PubMed統計，僅2022年是單細胞測序(xu)技術(shu)發文量已達5000+，雖然植(zhi)物(wu)單細胞測序(xu)文章數量近幾年一直呈現逐漸上升趨勢(shi)，影(ying)響因子均值都達到(dao)10+，利用原(yuan)(yuan)生質體分離技術(shu)( PI, protoplast isolation )進(jin)(jin)行植(zhi)物(wu)單細胞轉錄組(zu)測序(xu)的研(yan)究(jiu)(jiu)已經有(you)(you)了較大進(jin)(jin)展，但相較于(yu)在(zai)人和動物(wu)方向的研(yan)究(jiu)(jiu)以及產出，植(zhi)物(wu)單細胞研(yan)究(jiu)(jiu)進(jin)(jin)展較緩慢，主要有(you)(you)以下原(yuan)(yuan)因： 1. 植物(wu)細胞(bao)細胞(bao)壁解離難度大； 2. 植物(wu)原生(sheng)質(zhi)體分離在(zai)細胞壁消化過程中，會誘導壓力應(ying)答基因的表(biao)達，人為(wei)引入轉錄偏差； 3. 植物原生質體的(de)直徑隨著(zhu)滲透壓變(bian)化(hua)而變(bian)化(hua)； 4. 原生質體脆弱，活性不穩定； 5. 植物細胞具(ju)有(you)多種細胞器及各種次(ci)生代謝物。
圖3：近十年單細胞測序技術發文統計（數據來源：PubMed） 對小鼠視覺皮層和腎臟的研究表明，單細胞核RNA測序（snRNA-seq）基因檢測與單細胞RNA測序（scRNA-seq）基本一致，且相比具有顯著優勢，包括減少解離偏差、冷凍樣品的兼容性、消除解離誘導的轉錄應激反應等[1]。細胞核是細胞的一個復雜且高度專門化的細胞器，它包含了細胞的大部分遺傳信息，并調節了大部分顯性細胞功能。在擬南芥根組織同一細胞中使用測序（snATAC-seq）進行的snRNA-seq和染色質可及性分析有助于在表觀基因組和轉錄組水平上定義基因調控程序[2]，并為植物單細胞研究提供了新的思路，植(zhi)物單細(xi)(xi)胞(bao)核轉錄組測序可以有效(xiao)克服以上(shang)困難，加快植(zhi)物單細(xi)(xi)胞(bao)測序研(yan)究進展。
植物單細胞核轉錄組測序(xu)（PN-seq）大致(zhi)流程(cheng)如下： i）植物樣本(ben)的(de)收(shou)集和速(su)凍；ii- iv）細胞核獲取；v）過(guo)濾(lv)和離心(xin)；vi）FACS去除碎片；vii）單細胞核分(fen)離捕獲；viii）測序(xu)文庫構(gou)建；ix）上(shang)機測序(xu)。 圖4：植物單細胞核轉錄組測序流程[3] 
下面一起來學習幾篇經典的植物(wu)單細胞文獻案例(li)吧。 圖5：植物單細胞測序應用 單細胞轉錄(lu)組分析水稻葉肉細胞中廣泛的單等位基因表達(da) Single-cell transcriptome analysis reveals widespread monoallelic gene expression in individual rice mesophyll cells. 2017, Science Bulletin. IF=20.5776. 中科院遺傳(chuan)發育研究(jiu)所焦雨鈴(ling)研究(jiu)團隊從秈稻（93-11）和粳稻（Nipponbare）近交系以及它們的F1發芽5天后幼苗葉片中分離收集單個葉肉細胞，測量了32個細胞的單細胞轉錄組，研究單等位基因表達（monoallelic gene expression，是指在二倍體生物的細胞中一個基因的全部轉錄本均來自一個等位基因的現象）模式。研究發現細胞中約三分之二的基因是單等位基因表達的，很大程度上可以通過兩個等位基因表達的隨機性和獨立性來解釋該現象，相比之下，之前的研究中基于普通轉錄組分析提出的兩種機制，即起源效應和等位基因抑制，并沒有在本次研究數據中得到充分支持。該研究在單細胞水平上揭示了單等位基因表達現象的普遍性和可能的機制，為進一步研究細胞內基因表達調控規律奠定了基礎。 圖6：植物單細胞測序應用 首篇擬南芥(jie)根(gen)組織單細胞(bao)轉錄圖譜 Spatiotemporal Developmental Trajectories in the Arabidopsis Root Revealed Using High-Throughput Single-Cell RNA Sequencing. 2019, Developmental Cel. IF=13.4168. 德國(guo)圖(tu)賓根大(da)學植物分子生物學中心(xin)研究(jiu)團隊收集了兩例擬南芥根系樣本，利用單細胞轉錄組測序技術共獲得了4727個細胞，構建了首個擬南芥根高分辨率單細胞圖譜。該圖譜提供了詳細的時空信息，確定了所有主要細胞類型的定義及表達特征，包括稀缺細胞類型。通過擬時序分析，揭示了從干細胞向分生細胞分化過程中所經歷的復雜發展軌跡，并通過基因調控網絡分析證實了細胞分化過程。總之，該研究為從時空視角研究擬南芥根組織細胞類型分化提供了詳細的方案。 圖7：擬南芥根細胞圖譜 首篇單細胞(bao)核轉錄組測序揭示擬南芥根中的多種細胞類型 FlsnRNA-seq: protoplasting-free full-length single-nucleus RNA profiling in plants. 2021, Genome Biology. IF=18.0095. 單細胞轉錄組圖譜在植物中的廣泛應用受到了原生質形成的先決條件的阻礙，原生質形成需要消化不同類型植物組織的細胞壁。南方科技大學生物系的翟繼先團隊提出了一種無原生質的單細胞研究方法——全長單細胞核轉錄組測序（flsnRNA-seq），在單個植物細胞核水平上，進行大規模全長RNA測序分析。通過結合10x genomics scRNA-seq和三代Nanopore全長轉錄組測序，利用scRNA-seq技術捕獲單個細胞中基因表達豐度信息，并以Nanopore長度長測序技術捕獲同源異構體信息，共捕獲1186個細胞核。研究者在擬南芥的根尖（通過原生質體得到單細胞數據較豐富）和胚乳（較難制備原生質體）中分別測試對比了抽核與制備原生質體得到的單細胞測序數據結果，很(hen)好地證(zheng)明了無原生質體(ti)的大規模(mo)單細(xi)胞(bao)核(he)測(ce)序(xu)足以(yi)用于擬南芥的細(xi)胞(bao)類型分(fen)類和標記(ji)基因鑒定(ding)。結果表明(ming)在(zai)單細胞(bao)水平上研究來自(zi)選擇(ze)性(xing)剪接和選擇(ze)性(xing)多腺苷(gan)酸(APA)的RNA異構體(ti)，并提供額外的轉錄組復雜性(xing)維度，這可能(neng)進(jin)一步(bu)改善(shan)不同細胞(bao)類型的聚集或特(te)征。 圖8：擬南芥單細胞測序和全長單細胞核測序
派森諾生物(wu)多年以來一直深耕于(yu)單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)技(ji)術推廣與發展，并(bing)累積了豐(feng)富單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)測序經驗，植(zhi)(zhi)物(wu)樣本包括擬南芥(jie)、水稻、玉米(mi)、小麥、煙草、楊(yang)樹、銀杏、棉花、丹參等，并(bing)推出了植(zhi)(zhi)物(wu)單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)核提取聯合(he)流式去(qu)除碎(sui)片(pian)，為植(zhi)(zhi)物(wu)單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)測序研究保駕護航。
參(can)考文(wen)獻： [1] Wu H, Kirita Y, Donnelly E L, et al. Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis[J]. Journal of the American Society of Nephrology: JASN, 2019, 30(1). [2] Farmer A, Thibivilliers S, Ryu K H, et al. Single-nucleus RNA and ATAC sequencing reveals the impact of chromatin accessibility on gene expression in Arabidopsis roots at the single-cell level[J]. Molecular Plant, 2021, 14(3):12. [3] Dy S F, Jm M, Braeuning C, et al. Single-nuclei RNA-sequencing of plants. Cold Spring Harbor Laboratory, 2020.
