與二代(dai)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)技(ji)(ji)術(shu)(shu)(shu)相比(bi)，三(san)代(dai)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)技(ji)(ji)術(shu)(shu)(shu)具有(you)(you)(you)讀(du)長(chang)長(chang)、無(wu)GC偏好性的(de)(de)(de)特點(dian)(dian)。雖然目前三(san)代(dai)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)技(ji)(ji)術(shu)(shu)(shu)單條測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)序(xu)(xu)(xu)(xu)列的(de)(de)(de)錯(cuo)誤率高于(yu)二代(dai)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)技(ji)(ji)術(shu)(shu)(shu)，但是由于(yu)這些(xie)錯(cuo)誤都是隨機的(de)(de)(de)，因(yin)此可以通過提高測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)深(shen)度來有(you)(you)(you)效地減少錯(cuo)誤率。三(san)代(dai)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)技(ji)(ji)術(shu)(shu)(shu)的(de)(de)(de)這些(xie)特點(dian)(dian)，使其在基(ji)因(yin)組(zu)從頭組(zu)裝(zhuang)方面大顯身手(shou)，能夠(gou)(gou)有(you)(you)(you)效地提高組(zu)裝(zhuang)序(xu)(xu)(xu)(xu)列contig N50的(de)(de)(de)長(chang)度。但是想要(yao)得到染色體級(ji)別的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)組(zu)組(zu)裝(zhuang)序(xu)(xu)(xu)(xu)列，光(guang)靠三(san)代(dai)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)技(ji)(ji)術(shu)(shu)(shu)還是不夠(gou)(gou)的(de)(de)(de)，還需要(yao)借(jie)助其他的(de)(de)(de)技(ji)(ji)術(shu)(shu)(shu)手(shou)段(duan)(duan)。比(bi)較常用(yong)的(de)(de)(de)手(shou)段(duan)(duan)有(you)(you)(you)遺傳圖譜、長(chang)插(cha)入片段(duan)(duan)文庫以及光(guang)學(xue)圖譜等技(ji)(ji)術(shu)(shu)(shu)手(shou)段(duan)(duan)。

長插(cha)入(ru)片(pian)段文(wen)(wen)(wen)庫(ku)(ku)能夠(gou)(gou)(gou)跨過較(jiao)大的(de)(de)重復(fu)片(pian)段的(de)(de)區域，因(yin)(yin)(yin)(yin)而(er)在(zai)以(yi)往的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)組(zu)(zu)(zu)裝(zhuang)中都(dou)發(fa)揮(hui)著重要(yao)作用(yong)(yong)。與BAC庫(ku)(ku)等長插(cha)入(ru)片(pian)段文(wen)(wen)(wen)庫(ku)(ku)相比(bi)(bi)，fosmid庫(ku)(ku)具(ju)有(you)構(gou)(gou)建(jian)時間短(duan)、花(hua)費較(jiao)低(di)(di)、基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)覆蓋均勻等特點。將這(zhe)些長片(pian)段文(wen)(wen)(wen)庫(ku)(ku)再構(gou)(gou)建(jian)小的(de)(de)subclone，然(ran)后利用(yong)(yong)一代測序(xu)技(ji)術(shu)測序(xu)能夠(gou)(gou)(gou)獲得(de)(de)(de)精確的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)信息（clone-based 組(zu)(zu)(zu)裝(zhuang)策(ce)略(lve)）。目前很(hen)多模式(shi)生物的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)都(dou)是(shi)(shi)基(ji)(ji)(ji)(ji)于(yu)這(zhe)種策(ce)略(lve)來構(gou)(gou)建(jian)的(de)(de)，比(bi)(bi)如(ru)人，水(shui)(shui)稻，擬(ni)南芥等。但(dan)是(shi)(shi)這(zhe)種策(ce)略(lve)構(gou)(gou)建(jian)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)序(xu)列費用(yong)(yong)非常高。直接對這(zhe)種長片(pian)段文(wen)(wen)(wen)庫(ku)(ku)的(de)(de)兩端測序(xu)，獲得(de)(de)(de)的(de)(de)序(xu)列能夠(gou)(gou)(gou)用(yong)(yong)于(yu)構(gou)(gou)建(jian)scaffold，提高全基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)鳥槍法測序(xu)策(ce)略(lve)的(de)(de)組(zu)(zu)(zu)裝(zhuang)片(pian)段長度(du)。新興(xing)的(de)(de)光學圖譜技(ji)術(shu)根據內切酶(mei)酶(mei)切位點的(de)(de)信息，能夠(gou)(gou)(gou)提供幾(ji)百Kb到幾(ji)Mb范圍的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)物理圖譜。此(ci)方法獲得(de)(de)(de)的(de)(de)光學圖譜也可以(yi)用(yong)(yong)于(yu)構(gou)(gou)建(jian)scaffold，與fosmid庫(ku)(ku)相比(bi)(bi)，更加(jia)快速(su)，而(er)且花(hua)費低(di)(di)。但(dan)是(shi)(shi)由于(yu)短(duan)的(de)(de)contig（<100 Kb）上(shang)缺少酶(mei)切位點，因(yin)(yin)(yin)(yin)而(er)使用(yong)(yong)此(ci)種方法無法錨定到scaffold上(shang)。遺傳圖譜則能夠(gou)(gou)(gou)將contig/scaffold錨定到linkage group上(shang)，使組(zu)(zu)(zu)裝(zhuang)水(shui)(shui)平(ping)達到染(ran)色(se)體級別(bie)。需要(yao)注(zhu)意(yi)的(de)(de)是(shi)(shi)，如(ru)果contig/scaffold組(zu)(zu)(zu)裝(zhuang)的(de)(de)效果不(bu)好，加(jia)上(shang)遺傳圖譜，雖然(ran)可以(yi)得(de)(de)(de)到染(ran)色(se)體級別(bie)的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)組(zu)(zu)(zu)裝(zhuang)水(shui)(shui)平(ping)，但(dan)是(shi)(shi)序(xu)列中會含有(you)大量的(de)(de)N。基(ji)(ji)(ji)(ji)于(yu)這(zhe)種基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)序(xu)列的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)注(zhu)釋水(shui)(shui)平(ping)等都(dou)比(bi)(bi)較(jiao)低(di)(di)，不(bu)利于(yu)后續功能研究。

今年5月，Nature communications在線發表了一個迄今為止最高質量的植物基因組序列。該研究組裝的物種是水稻（Oryza sativa, 2n=2x=24），品種是Shuhui498，組裝策略綜合利用了三代單分子測序技術、fosmid文庫和Bionano光學圖譜，最終組裝的序列僅有1%的缺失。水稻現有的參考基因組為日本晴（Nipponbare），是基于clone-based的策略構建的。Shuhui498最終組裝的準確性和完整性都優于日本晴。下面小編就來分享一下這篇文章，看如果利用這些技術得到了如此高質量的基因組序列。

測(ce)序策(ce)略(lve)

本研(yan)究(jiu)(jiu)獲(huo)(huo)得(de)(de)了(le)47 Gb的(de)PacBio的(de)序(xu)列，覆(fu)蓋(gai)(gai)基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)~118 X。同時構(gou)(gou)建(jian)(jian)了(le)插入片(pian)段(duan)大小為(wei)(wei)(wei)~40 Kb 的(de)fosmid文庫(ku)，564個fosmid pools，每(mei)(mei)個pools有(you)~1,000個clone。對這(zhe)些(xie)fosmid文庫(ku)，本研(yan)究(jiu)(jiu)采用(yong)了(le)GBS的(de)測(ce)序(xu)方(fang)法，每(mei)(mei)個tag的(de)測(ce)序(xu)深度為(wei)(wei)(wei)~3 X，共(gong)(gong)(gong)獲(huo)(huo)得(de)(de)6.3 Gb的(de)數(shu)據(ju)(ju)(ju)(ju)。本研(yan)究(jiu)(jiu)還構(gou)(gou)建(jian)(jian)了(le)Shuhui498和Nipponbare的(de)重組(zu)(zu)(zu)自交系。為(wei)(wei)(wei)了(le)構(gou)(gou)建(jian)(jian)遺(yi)傳圖(tu)譜(pu)，作者挑選(xuan)了(le)F3群體(ti)中(zhong)364個個體(ti)，采用(yong)GBS測(ce)序(xu)的(de)方(fang)法，每(mei)(mei)個tag的(de)測(ce)序(xu)深度為(wei)(wei)(wei)~4 X，每(mei)(mei)個個體(ti)平均測(ce)序(xu)數(shu)據(ju)(ju)(ju)(ju)為(wei)(wei)(wei)73 Mb，一共(gong)(gong)(gong)獲(huo)(huo)得(de)(de)26.9 Gb的(de)數(shu)據(ju)(ju)(ju)(ju)。本研(yan)究(jiu)(jiu)獲(huo)(huo)得(de)(de)了(le)99 Gb的(de)光(guang)(guang)學圖(tu)譜(pu)數(shu)據(ju)(ju)(ju)(ju)，基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)覆(fu)蓋(gai)(gai)度為(wei)(wei)(wei)250 X。構(gou)(gou)建(jian)(jian)這(zhe)些(xie)光(guang)(guang)學圖(tu)譜(pu)的(de)分子片(pian)段(duan)>100 Kb, N50為(wei)(wei)(wei)202 Kb。這(zhe)些(xie)數(shu)據(ju)(ju)(ju)(ju)組(zu)(zu)(zu)裝后共(gong)(gong)(gong)得(de)(de)到453個genome map，總長度為(wei)(wei)(wei)406 Mb，N50為(wei)(wei)(wei)2.48 Mb。此外，本研(yan)究(jiu)(jiu)也構(gou)(gou)建(jian)(jian)了(le)插入片(pian)段(duan)為(wei)(wei)(wei)450 bp的(de)二代測(ce)序(xu)文庫(ku)并獲(huo)(huo)得(de)(de)了(le)38.7 GB的(de)測(ce)序(xu)數(shu)據(ju)(ju)(ju)(ju)，覆(fu)蓋(gai)(gai)基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)~100 X。本研(yan)究(jiu)(jiu)還對多(duo)個組(zu)(zu)(zu)織進(jin)行了(le)RNA-seq，用(yong)于(yu)更好的(de)注釋基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)和評(ping)估組(zu)(zu)(zu)裝效果。具體(ti)的(de)測(ce)序(xu)策(ce)略見下表。

測序的策略

組裝策(ce)略(lve)

1. Contig構建

首先，采用PBcR pipeline對原始的(de)PacBio序(xu)(xu)(xu)列糾錯(cuo)，獲得(de)16.2 Gb的(de)糾錯(cuo)后序(xu)(xu)(xu)列。然后采用PBcR的(de)low stringency (LS) 和high stringency (HS)模式、CANU和Falcon組裝糾錯(cuo)后序(xu)(xu)(xu)列。同時(shi)，將(jiang)fosmid測(ce)序(xu)(xu)(xu)的(de)序(xu)(xu)(xu)列比(bi)對到糾錯(cuo)后的(de)序(xu)(xu)(xu)列上，挑選出含有(you)fosmid測(ce)序(xu)(xu)(xu)序(xu)(xu)(xu)列的(de)PacBio序(xu)(xu)(xu)列，并對每個fosmid pool的(de)序(xu)(xu)(xu)列單獨組裝，獲得(de)fosmid contig。contig組裝的(de)詳(xiang)細(xi)結果(guo)見下表：

Contig組(zu)裝的結果

2. 遺(yi)傳(chuan)圖譜(pu)構建并將contig錨(mao)定到遺(yi)傳(chuan)圖譜(pu)上(shang)

PBcR LS組裝的contig N50最長，因此被選為(wei)reference來構建(jian)遺(yi)傳圖(tu)(tu)譜(pu)。該(gai)(gai)遺(yi)傳圖(tu)(tu)譜(pu)共獲得12個(ge)linkage group （LG）。497個(ge)contig錨定到(dao)了該(gai)(gai)遺(yi)傳圖(tu)(tu)譜(pu)上，序列總(zong)長為(wei)355.9 Mb。

3. Super-contig構建(jian)

被錨定到遺傳圖譜上的(de)(de)(de)497個(ge)contig，被進(jin)一步連(lian)(lian)成(cheng)(cheng)super-contig。原(yuan)理(li)就(jiu)是如果(guo)fosmid contig與兩個(ge)contig有overlap，那(nei)么(me)這(zhe)兩個(ge)contig就(jiu)被連(lian)(lian)成(cheng)(cheng)一個(ge)super-contig。全(quan)基因組組裝(zhuang)的(de)(de)(de)時(shi)候，也會產生(sheng)一些(xie)錯(cuo)誤(wu)的(de)(de)(de)contig。這(zhe)些(xie)contig也能夠在super-contig構(gou)建的(de)(de)(de)過程中被糾正。原(yuan)理(li)就(jiu)是如果(guo)一個(ge)contig與周圍(wei)的(de)(de)(de)contig有overlap，而且(qie)這(zhe)個(ge)overlap也被fosmid contig驗證，那(nei)么(me)這(zhe)個(ge)contig就(jiu)會在有overlap的(de)(de)(de)地(di)方分開，分成(cheng)(cheng)多個(ge)contig。具體(ti)的(de)(de)(de)原(yuan)理(li)圖見(jian)下圖：

Super-contig構建(jian)的原理

4. Super-contig糾錯(cuo)

Bionano構(gou)建的(de)genome map被用于(yu)super-contig的(de)糾錯。作者首先查看了著絲粒(li)和(he)近端(duan)粒(li)區域(yu)，發現著絲粒(li)區域(yu)與genome map完全(quan)一致，而24個近端(duan)粒(li)區域(yu)中有21個與genome map一致。然后Quiver被用于(yu)來糾正≤2 Kb的組裝錯誤。

5. 組裝效果評估(gu)

將Illumina DNA的短序(xu)列(lie)，RNA-seq的數據(ju)比(bi)對到組裝(zhuang)的基(ji)因組上，評估(gu)出基(ji)因組組裝(zhuang)的堿基(ji)錯(cuo)誤率<0.0017%。這(zhe)(zhe)個錯(cuo)誤率低于水(shui)稻現有(you)(you)(you)的參考基(ji)因組日本(ben)晴的序(xu)列(lie)。而存(cun)在于最(zui)終(zhong)組裝(zhuang)序(xu)列(lie)的fosmid contig的堿基(ji)錯(cuo)誤率為0.0017%，略高(gao)于其它區域，可能是以為這(zhe)(zhe)些區域含有(you)(you)(you)高(gao)重復序(xu)列(lie)。基(ji)于這(zhe)(zhe)個比(bi)對結果和genome map的比(bi)對結果，大約有(you)(you)(you)1%的序(xu)列(lie)未組裝(zhuang)到最(zui)終(zhong)的基(ji)因組序(xu)列(lie)中。

Shuhui498與(yu)日本晴(qing)基因組比較

比(bi)較(jiao)Shuhui498與日(ri)本晴基(ji)因(yin)(yin)組(zu)序(xu)列(lie)，發現(xian)Shuhui498的著絲粒區域更完整、含有(you)更少(shao)的葉(xie)綠體和線粒體序(xu)列(lie)。并且，二(er)者(zhe)(zhe)在(zai)染色體上的相似(si)性非常高(gao)，不過也存在(zai)~250萬個(ge)SNP和很多的大片(pian)段結構變異（具體見下圖）。比(bi)較(jiao)二(er)者(zhe)(zhe)的基(ji)因(yin)(yin)序(xu)列(lie)發現(xian)，二(er)者(zhe)(zhe)只有(you)~27%的基(ji)因(yin)(yin)蛋白質(zhi)序(xu)列(lie)完全一(yi)致。雖然二(er)者(zhe)(zhe)的重(zhong)復序(xu)列(lie)比(bi)例一(yi)致，但是(shi)重(zhong)復序(xu)列(lie)的內容卻不一(yi)樣。

Shuhui498與其它水稻基(ji)因組比較(jiao)

最后，本研究(jiu)比(bi)較了Shuhui498基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)和(he)其它(ta)17個 高覆蓋測序(xu)的水稻基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)序(xu)列。Shuhui498與(yu)同屬于(yu)秈稻的MH63 和(he) ZS97基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)更相似。同時，本研究(jiu)鑒(jian)定(ding)了Shuhui498和(he)日本晴基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)中相對(dui)于(yu)其它(ta)水稻基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)的presence variation (PV)，發現PV廣泛存在。

總結

利用三代單(dan)分子(zi)測序技術(shu)，再結合長插入片段文庫、光學圖譜(pu)和遺傳圖譜(pu)數據，本研究構建了一(yi)個僅有1%缺(que)失的(de)基因組序列，是迄今(jin)為止(zhi)質量最(zui)高的(de)植物基因組。

參考文獻：

Du H, et al. Sequencing and de novo assembly of a near complete indica rice genome. Nat Commun. 2017, 8:15324. doi: 10.1038/ncomms15324.