不(bu)同(tong)(tong)解剖部(bu)位的身體皮膚(fu)因其起(qi)源不(bu)同(tong)(tong)而顯示出不(bu)同(tong)(tong)的基因表達模式，且這(zhe)種內在的異質(zhi)性可以在成年人(ren)中(zhong)一直維持(chi)。然而，不(bu)同(tong)(tong)部(bu)位皮膚(fu)的高分辨率單細胞特異性較(jiao)少被揭(jie)示。

該研究收集了3頭(tou)雌性(xing)CH豬（180日(ri)）6個不同解(jie)剖部(bu)位(wei)皮膚(fu)(fu)：頭(tou)部(bu)、耳朵、肩部(bu)、背(bei)部(bu)、腹部(bu)、腿(tui)部(bu)以及3頭(tou)雌性(xing)LW豬（180日(ri)）背(bei)部(bu)皮膚(fu)(fu)樣本(ben)進行(xing)高通量(liang)單(dan)細胞轉錄組測(ce)序（scRNA-seq）。

1. 完整的豬皮膚單細胞轉錄組圖譜

該研究完整繪制了豬皮膚單細(xi)胞(bao)轉錄組圖譜(pu)，且詳細(xi)分(fen)析了主要細(xi)胞(bao)群(qun)SMCs（平滑肌細(xi)胞(bao)）、ECs（內皮細(xi)胞(bao)）、FBs（成纖維細(xi)胞(bao)）在不同部位皮膚的異質性，從(cong)單細(xi)胞(bao)水(shui)平揭示(shi)了其在不同部位皮膚的表型特征。

2. 挖掘出影響成華豬獨特皮膚厚度的關鍵基因及信息傳遞機制

該研(yan)究采用(yong)CellChat完整構建了豬(zhu)皮(pi)膚細(xi)胞間(jian)的(de)(de)通(tong)(tong)訊交(jiao)流網絡，提出(chu)FBs、SMCs和ECs之間(jian)的(de)(de)通(tong)(tong)訊交(jiao)流機制(zhi)。并(bing)且，該研(yan)究挖掘(jue)出(chu)COL11A1、TNN、INHBA基(ji)因是影響成華(hua)豬(zhu)獨特皮(pi)膚厚度的(de)(de)關(guan)鍵(jian)基(ji)因，COLLAGEN和LAMININ信號(hao)通(tong)(tong)路是介導(dao)成纖維細(xi)胞與(yu)平滑肌細(xi)胞/表皮(pi)干細(xi)胞的(de)(de)主(zhu)要細(xi)胞通(tong)(tong)訊模式。

圖1 技術路線(xian)

1. 成華（CH）豬不同解剖部位皮膚的單細胞轉錄組圖譜繪制

研(yan)(yan)究(jiu)團隊對CH豬(zhu)(zhu)的(de)頭部、耳朵、肩部、背部、腹部和腿(tui)部的(de)皮(pi)(pi)(pi)膚(fu)組織進行scRNA-seq，獲(huo)得了233,715個(ge)細(xi)胞(bao)，聚類(lei)定義后(hou)分出7個(ge)細(xi)胞(bao)群(qun)。每種細(xi)胞(bao)類(lei)型的(de)Marker基因(yin)表(biao)達譜揭示其獨特(te)的(de)生理功能相關的(de)特(te)征。考慮到跨物種，本研(yan)(yan)究(jiu)對豬(zhu)(zhu)、人類(lei)和小鼠皮(pi)(pi)(pi)膚(fu)的(de)細(xi)胞(bao)圖譜進行對比，發現三個(ge)物種的(de)細(xi)胞(bao)類(lei)型相似，但細(xi)胞(bao)數占(zhan)比不同，可(ke)能是CH豬(zhu)(zhu)獨特(te)的(de)皮(pi)(pi)(pi)膚(fu)厚度導(dao)致細(xi)胞(bao)類(lei)型比例(li)的(de)差異（例(li)如SMC和EC細(xi)胞(bao)數量(liang)過多），作(zuo)者建(jian)議可(ke)將豬(zhu)(zhu)皮(pi)(pi)(pi)膚(fu)組織作(zuo)為人類(lei)皮(pi)(pi)(pi)膚(fu)模型用于(yu)單(dan)細(xi)胞(bao)水平上(shang)的(de)研(yan)(yan)究(jiu)。

圖2 CH豬不同皮(pi)膚(fu)解剖部位(wei)單細胞轉錄組(zu)圖譜

2. 平滑肌細胞（SMCs）在不同解剖部位皮膚的異質性差異顯著

SMC在(zai)(zai)皮膚組(zu)織(zhi)中形成血管和APM中發(fa)揮著(zhu)關鍵作用，尚無研究以單細(xi)胞(bao)分(fen)辨率對皮膚SMC進行表征(zheng)。t-SNE分(fen)析將(jiang)SMC分(fen)為五個亞群（cluster 0、2、5、6和 13），GO分(fen)析表明SMC在(zai)(zai)血管功能和穩(wen)態(tai)、部分(fen)膠原(yuan)蛋白結(jie)合以及皮膚組(zu)織(zhi)的(de)免疫反(fan)應中發(fa)揮著(zhu)重(zhong)要作用。結(jie)合GO分(fen)析和Marker基因(yin)表達水平，推(tui)測cluster 2是(shi)間(jian)充質樣(yang)型細(xi)胞(bao)，cluster 5和cluster 6是(shi)巨噬(shi)細(xi)胞(bao)。研究團隊(dui)通過(guo)Monocle算法進行擬時間(jian)軌跡分(fen)析，獲得(de) SMC分(fen)化到間(jian)充質樣(yang)型以及從間(jian)充質樣(yang)型到類巨噬(shi)細(xi)胞(bao)的(de)動態(tai)變化，同時特征(zheng)基因(yin)集的(de)動態(tai)變化也(ye)驗(yan)證了這個結(jie)論。

圖3 不同解剖部位皮膚平滑肌細胞（SMC）的異質(zhi)性

SMCs的(de)(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)數量在不同(tong)皮膚(fu)(fu)部(bu)(bu)(bu)位表現(xian)出顯著(zhu)差異，而SMC亞群(qun)的(de)(de)(de)(de)分布比例(li)相(xiang)(xiang)似的(de)(de)(de)(de)。作者分析與(yu)ECM整合(he)蛋(dan)白(bai)、免疫反應(ying)相(xiang)(xiang)關的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)在不同(tong)皮膚(fu)(fu)部(bu)(bu)(bu)位的(de)(de)(de)(de)表達(da)變化，發(fa)現(xian)免疫反應(ying)基(ji)(ji)因(yin)(yin)與(yu)肩部(bu)(bu)(bu)皮膚(fu)(fu)密切相(xiang)(xiang)關，ECM整合(he)蛋(dan)白(bai)基(ji)(ji)因(yin)(yin)與(yu)頭、背(bei)部(bu)(bu)(bu)、肩部(bu)(bu)(bu)的(de)(de)(de)(de)皮膚(fu)(fu)緊密相(xiang)(xiang)關。此外，作者使用單細胞(bao)(bao)調控(kong)網絡推理和(he)聚類（single-cell regulatory network inference and clustering, SCENIC），獲得EGR1、ATF3、NFKB1、PRDM1、REL等關鍵(jian)轉錄因(yin)(yin)子(zi)及其相(xiang)(xiang)關靶基(ji)(ji)因(yin)(yin)。尤其是(shi)ATF3和(he)EGR1是(shi)主要調控(kong)背(bei)部(bu)(bu)(bu)皮膚(fu)(fu)的(de)(de)(de)(de)靶基(ji)(ji)因(yin)(yin)。以上結果為(wei)不同(tong)部(bu)(bu)(bu)位皮膚(fu)(fu)SMC的(de)(de)(de)(de)固有異質性(xing)提供(gong)了很好的(de)(de)(de)(de)見解(jie)。

3. 內皮細胞（ECs）在不同解剖部位皮膚的基因及代謝通路等表現顯著異質性

前人研(yan)究發(fa)現EC是(shi)血管系統的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)礎，主要參與(yu)調節血液(ye)和(he)(he)皮膚(fu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)穩態(tai)。EC細(xi)胞群再分類成(cheng)(cheng)小動脈EC（cluster7和(he)(he)10）、毛(mao)細(xi)血管EC（cluster 3）、淋巴管EC（cluster 11）。擬時軌跡分析(xi)展示了(le)(le)從動脈開(kai)始到(dao)靜脈結束的(de)(de)(de)(de)(de)(de)有序血管軸，并形(xing)成(cheng)(cheng)了(le)(le)動脈- 靜脈吻合的(de)(de)(de)(de)(de)(de)趨勢。由于EC表(biao)(biao)型(xing)(xing)(xing)表(biao)(biao)現出(chu)不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分子(zi)和(he)(he)功(gong)能，作者(zhe)也進一步(bu)探討了(le)(le)這些EC表(biao)(biao)型(xing)(xing)(xing)相(xiang)關基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)達水平(ping)，發(fa)現不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)EC表(biao)(biao)型(xing)(xing)(xing)顯著高表(biao)(biao)達不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)，包括與(yu)整(zheng)合素、免疫和(he)(he)代謝相(xiang)關的(de)(de)(de)(de)(de)(de)多個(ge)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)，體現EC表(biao)(biao)型(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)功(gong)能多樣性。為進一步(bu)確認六(liu)個(ge)不(bu)同(tong)解(jie)剖(pou)部(bu)位(wei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de) EC 表(biao)(biao)型(xing)(xing)(xing)異質性，作者(zhe)詳細(xi)比(bi)較了(le)(le)整(zheng)合素、免疫和(he)(he)代謝途(tu)徑的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)表(biao)(biao)達水平(ping)。不(bu)同(tong)部(bu)位(wei)EC表(biao)(biao)型(xing)(xing)(xing)相(xiang)關通路基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)表(biao)(biao)達的(de)(de)(de)(de)(de)(de)豐富結果(guo)顯示了(le)(le)不(bu)同(tong)解(jie)剖(pou)部(bu)位(wei)皮膚(fu)EC的(de)(de)(de)(de)(de)(de)異質性。此外，作者(zhe)構(gou)建EC單細(xi)胞轉錄因(yin)(yin)(yin)(yin)子(zi)調控(kong)網絡。

圖(tu)4 不同解(jie)剖(pou)部位皮膚平滑肌細胞（SMCs）的異質性

4. 成纖維細胞（FBs）不同解剖部位皮膚的異質性與皮膚形態差異相關

FB合成ECM，形成皮(pi)膚(fu)真皮(pi)的結(jie)(jie)締(di)組織(zhi)，以維持皮(pi)膚(fu)形態(tai)，如厚度(du)和穩(wen)態(tai)。切片染色結(jie)(jie)果表明，CH豬不同(tong)部(bu)位的皮(pi)膚(fu)厚度(du)存在(zai)顯著(zhu)差(cha)異(yi)，例(li)如背(bei)(bei)部(bu)平均厚度(du)為5.48mm，而耳朵(duo)為1.52mm。從整體皮(pi)膚(fu)切片來看，不同(tong)部(bu)位的皮(pi)膚(fu)組織(zhi)形態(tai)存在(zai)一定(ding)差(cha)異(yi)，膠原纖維的稀疏程度(du)或(huo)附屬器的數量以及真皮(pi)厚度(du)從背(bei)(bei)部(bu)、頭部(bu)、肩部(bu)、腿部(bu)、腹部(bu)到耳朵(duo)依(yi)次遞減。

那么(me)不同皮膚部位ECM積(ji)累的差(cha)異是否是由 FB 異質性引起呢(ni)？

研究團(tuan)隊從頭部(bu)(bu)、耳(er)部(bu)(bu)、背部(bu)(bu)、肩部(bu)(bu)、腹部(bu)(bu)和(he)腿部(bu)(bu)六個不同(tong)部(bu)(bu)位細胞聚類(lei)分析(xi)，發(fa)(fa)現(xian)(xian) cluster1、8、9和(he)12與ECM組織、膠(jiao)(jiao)原(yuan)蛋(dan)白密(mi)切相(xiang)關(guan)。比(bi)較(jiao)不同(tong)部(bu)(bu)位基(ji)(ji)因的(de)表達水平，GO分析(xi)發(fa)(fa)現(xian)(xian)所有組別比(bi)較(jiao)的(de)結果與ECM、細胞外區域、細胞外空間(jian)和(he)含有膠(jiao)(jiao)原(yuan)蛋(dan)白的(de)ECM通(tong)路(lu)相(xiang)關(guan)；KEGG分析(xi)發(fa)(fa)現(xian)(xian)主要通(tong)路(lu)與ECM的(de)產生(sheng)緊密(mi)相(xiang)關(guan)。作者認(ren)為TNN、COL11A1和(he)INHBA是引發(fa)(fa)ECM積累的(de)關(guan)鍵候選基(ji)(ji)因。

FBs相關基(ji)因(yin)表達特征可以作為位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)置(zhi)(zhi)同一(yi)性的重(zhong)要分子線索(suo)，比較(jiao)不同部(bu)(bu)(bu)位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)基(ji)因(yin)表達差異(yi)結(jie)果表明(ming)厚部(bu)(bu)(bu)位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)（頭(tou)部(bu)(bu)(bu)、肩部(bu)(bu)(bu)和(he)(he)(he)背部(bu)(bu)(bu)）和(he)(he)(he)薄(bo)部(bu)(bu)(bu)位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)（耳朵、腹部(bu)(bu)(bu)和(he)(he)(he)腿(tui)部(bu)(bu)(bu)）的 FBs 基(ji)因(yin)表達模(mo)式(shi)部(bu)(bu)(bu)分由每個結(jie)構的位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)置(zhi)(zhi)定(ding)義；上半(ban)(ban)身(shen)部(bu)(bu)(bu)位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)（頭(tou)部(bu)(bu)(bu)、耳朵和(he)(he)(he)肩部(bu)(bu)(bu)）和(he)(he)(he)下半(ban)(ban)身(shen)部(bu)(bu)(bu)位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)（背部(bu)(bu)(bu)、腹部(bu)(bu)(bu)和(he)(he)(he)腿(tui)部(bu)(bu)(bu)）的由其起(qi)源的解(jie)剖部(bu)(bu)(bu)位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)決定(ding)。

圖5 不(bu)同解(jie)剖部位皮膚內皮細(xi)胞(bao)（ECs）的(de)異質性(xing)

5. 不同品種豬皮膚的細胞異質性存在顯著差異

前期研究(jiu)發(fa)現，CH豬和LW豬的(de)(de)皮膚厚度存在顯著差異(yi)，皮膚組(zu)織和皮膚FB來源的(de)(de)小細(xi)胞外囊泡樣本經全轉錄組(zu)水平分(fen)析(xi)表現出基因表達上的(de)(de)差異(yi)變化。

那么皮(pi)(pi)膚細胞的異質性模式是否也存在于兩個豬群中，進(jin)而(er)導(dao)致皮(pi)(pi)膚厚度的差(cha)異呢？ 

首先，作(zuo)者(zhe)發現(xian)CH豬(zhu)(zhu)的(de)(de)平均真皮(pi)厚(hou)度(du)為5.29mm，而(er)LW豬(zhu)(zhu)的(de)(de)平均真皮(pi)厚(hou)度(du)僅為2.61mm。對LW豬(zhu)(zhu)背部(bu)皮(pi)膚(fu)也(ye)進行單細(xi)(xi)胞(bao)測序，獲得(de)18,411個細(xi)(xi)胞(bao)，6種(zhong)細(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)。比(bi)較兩(liang)個豬(zhu)(zhu)群(qun)的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)圖譜表明(ming)主要細(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)一(yi)致：仍(reng)然是SMC、EC和(he)FB；比(bi)較DEG結果發現(xian)FB基(ji)因(yin)表達顯(xian)著差(cha)異(yi)(yi)。作(zuo)者(zhe)又分別對主要三種(zhong)細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)DEG進行GO、KEGG分析(xi)發現(xian)EC細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)脂質(zhi)(zhi)代謝(xie)（LPCAT2 、 ENPP2 基(ji)因(yin)），ECM細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)的(de)(de)PPAR信號通(tong)路(lu)，FB細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)PI3K-AKT信號通(tong)路(lu)、蛋白(bai)質(zhi)(zhi)消化和(he)吸收、ECM-受(shou)體(ti)相(xiang)互作(zuo)用等有(you)顯(xian)著差(cha)異(yi)(yi)，以上結果表明(ming)皮(pi)膚(fu)組織(zhi)中的(de)(de) ECM 積(ji)累可(ke)能取決(jue)于解剖區域或豬(zhu)(zhu)群(qun)之間的(de)(de)這些基(ji)因(yin)表達的(de)(de)不同。此(ci)外，CH豬(zhu)(zhu)背部(bu)皮(pi)膚(fu)FB存(cun)在一(yi)系列特(te)異(yi)(yi)基(ji)因(yin)，如(ru)COL1A1、POSTN、TNN、INHBA、IGF1、COL11A1，而(er)LW豬(zhu)(zhu)背部(bu)皮(pi)膚(fu)FB的(de)(de)特(te)定基(ji)因(yin)有(you)TM4SF1、CCL2和(he)NGFR，說明(ming)FB具(ju)有(you)品種(zhong)轉錄組特(te)性。

圖6 不同解剖部(bu)位皮膚成纖維(wei)細胞（FBs）的異質性

6. 皮膚中不同細胞間膠原蛋白和層粘連蛋白代謝途徑信號通訊信息交流豐富

為了(le)研究(jiu)皮膚組織中不同細胞(bao)(bao)間(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)交流(liu)，作者(zhe)(zhe)使用R包CellChat建立了(le)皮膚細胞(bao)(bao)間(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)通(tong)信(xin)網絡，分(fen)析得(de)到(dao)36條信(xin)號通(tong)路。其中，COLLAGEN（膠原(yuan)蛋(dan)(dan)白）和(he)LAMININ（層粘蛋(dan)(dan)白）通(tong)路在細胞(bao)(bao)間(jian)(jian)(jian)表(biao)現出高度豐(feng)富的(de)(de)(de)信(xin)號作用。作者(zhe)(zhe)分(fen)析了(le)三(san)種(zhong)主(zhu)要細胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)14個(ge)cluster中的(de)(de)(de)膠原(yuan)蛋(dan)(dan)白/層粘連蛋(dan)(dan)白通(tong)路：SMCs cluster 2、5、6和(he)ECs cluster7可能通(tong)過COLLAGEN/LAMININ通(tong)路中的(de)(de)(de) COL1A1/LAMA2配體、ITGA1+ITGB1受體積極參與細胞(bao)(bao)通(tong)訊。此外，SCENIC算法證明NFKB1是(shi)三(san)種(zhong)細胞(bao)(bao)類型DEG之間(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)共同調節子，EGR1和(he)ATF3調節子調節SMC和(he)EC中的(de)(de)(de)靶基因。

圖(tu)7 皮膚中各種細(xi)胞(bao)類型(xing)之(zhi)間的(de)信號交流

本研究繪制了豬皮膚較完整的單細胞轉錄組圖譜，結合皮膚表型探究3種主要細胞SMCs、ECs、FBs在不同組織部位的細胞異質性；通過擬時(shi)分析，描繪了SMCs、ECs細胞動態分化軌跡(ji)；進一(yi)步(bu)比較了CH豬(zhu)和LW豬(zhu)背部皮(pi)膚單(dan)細胞水平上的(de)基因表達及功能(neng)差(cha)異。最后，作者使用CellChat建(jian)立皮膚(fu)細(xi)胞間的通信(xin)網絡(luo)，探究各種細(xi)胞之間的信(xin)號(hao)交流(liu)機制。