2023-10-11
2023年(nian)9月12日，北京大學湯富酬團隊在(zai)Cell Research在(zai)線發表(biao)了一篇題(ti)為(wei)“scNanoCOOL-seq: a long-read single-cell sequencing method for multi-omics profiling within individual cells”的研(yan)(yan)究(jiu)論文。該(gai)研(yan)(yan)究(jiu)報(bao)道(dao)了一種(zhong)新(xin)興的單細(xi)胞(bao)多組(zu)(zu)學測序(xu)技術：scNanoCOOL-seq，該(gai)方法(fa)可以同時分(fen)析同一個(ge)細(xi)胞(bao)中的基(ji)因組(zu)(zu)（拷貝數變異）、DNA甲基(ji)化(hua)、染色質可及性和(he)轉錄組(zu)(zu)信(xin)息(xi)，從而(er)實現在(zai)單個(ge)細(xi)胞(bao)內(nei)進行多組(zu)(zu)學分(fen)析。
scNanoCOOL-seq是(shi)在(zai)scCOOL-seq和scNOMe-seq的(de)基(ji)礎上發展而來的(de)。scCOOL-seq/scNOMe-seq是(shi)一種單(dan)細胞(bao)多(duo)組學測序技術，可以(yi)同時檢測基(ji)因組、轉錄組、染色(se)質(zhi)可及性和DNA甲基(ji)化。傳(chuan)統的(de)單(dan)細胞(bao)測序方法(fa)主要依賴(lai)于二代(dai)測序平臺，其讀(du)長(chang)(chang)通(tong)常為300bp，難(nan)以(yi)滿足(zu)對長(chang)(chang)基(ji)因組區域內(nei)表觀遺傳(chuan)修飾與轉錄組互動關系的(de)深入研究需(xu)求。而基(ji)于三(san)代(dai)測序平臺的(de)測序方法(fa)（如Oxford Nanopore和PacBio SMRT）雖然具備高通(tong)量和長(chang)(chang)讀(du)長(chang)(chang)的(de)特(te)點(dian)，但在(zai)單(dan)細胞(bao)水平的(de)應用和多(duo)組學層面的(de)綜(zong)合研究仍(reng)然面臨(lin)挑(tiao)戰。
為(wei)了解決這個(ge)問題，研究人員開發(fa)了一(yi)種基(ji)(ji)于(yu)納米孔測序平臺的(de)scCOOL-seq方法，稱為(wei)scNanoCOOL-seq。scNanoCOOL-seq利用(yong)長(chang)度長(chang)測序，可以(yi)檢(jian)測全長(chang)CpG島(dao)（CGIs）和基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)啟動子的(de)表(biao)(biao)觀遺傳(chuan)特征(zheng)，以(yi)及具(ju)有結(jie)構變異（SVs）的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組區(qu)域。此外，它還提供了在(zai)單個(ge)細胞內分析等位基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)特異性表(biao)(biao)觀遺傳(chuan)狀態(tai)的(de)機(ji)會，例如(ru)印(yin)跡(ji)控制區(qu)域的(de)等位基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)特異性DNA甲(jia)基(ji)(ji)化和染色質可及性狀態(tai)，該方法已成功應用(yong)于(yu)分析小鼠的(de)早期和晚期囊泡(pao)，揭示了囊胚發(fa)育過(guo)程中DNA甲(jia)基(ji)(ji)化和染色質狀態(tai)的(de)動態(tai)變化。
1、技術路線
scNanoCOOL-seq技術主要采用(yong)亞硫酸氫鹽轉(zhuan)化和單條碼的(de)PCR擴增(zeng)策(ce)略，最終可(ke)以(yi)獲得(de)大約900個堿基對的(de)DNA片段。如圖1所示，scNanoCOOL-seq的(de)實驗流程(cheng)可(ke)以(yi)概(gai)括為以(yi)下(xia)幾(ji)個步驟(zou)：
以溫和的(de)方式裂(lie)解細(xi)胞(bao)，然后(hou)使用DNA轉移酶M.CviPI對單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)DNA進行甲基化處理(li)，接著(zhu)將單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)的(de)核和細(xi)胞(bao)質分離(li)。
對于分離(li)出的(de)細胞核部分：經過(guo)亞(ya)硫酸氫鹽(yan)處理和PBAT樣本文庫構(gou)建后，進行單條碼PCR擴(kuo)增，以(yi)便在納米孔(kong)平臺上進行單分子(zi)測序。
對(dui)于細胞質(zhi)部分：用于構建(jian)scRNA-seq文庫(ku)（采用優化的(de)STRT-seq方法）。
圖1 scNanoCOOL-seq技術(shu)原理示意圖
2、可行性驗證
研究人(ren)(ren)員使用了人(ren)(ren)類胚胎(tai)干細(xi)胞和(he)人(ren)(ren)類單(dan)核細(xi)胞等樣本，以(yi)評估scNanoCOOL-seq的性能。在這些實驗中，研究人(ren)(ren)員評估了scNanoCOOL-seq在檢測基(ji)(ji)因(yin)組(zu)(zu)（拷貝數變異）（圖2a）、轉錄組(zu)(zu)、染(ran)色質(zhi)可及性（圖2b, c）和(he)DNA甲(jia)基(ji)(ji)化（圖2b, d）方(fang)面的表(biao)現(xian)，并與其他單(dan)細(xi)胞測序技術進行(xing)了比較。結果表(biao)明(ming)，scNanoCOOL-seq可以(yi)在單(dan)個細(xi)胞內進行(xing)多(duo)組(zu)(zu)學(xue)分析(xi)，并且可以(yi)檢測全長CpG島（CGIs）和(he)基(ji)(ji)因(yin)啟動子的表(biao)觀(guan)遺傳特征(zheng)，以(yi)及具有結構變異（SVs）的基(ji)(ji)因(yin)組(zu)(zu)區域(yu)。此外，scNanoCOOL-seq還(huan)可以(yi)分析(xi)單(dan)個細(xi)胞內的等位(wei)基(ji)(ji)因(yin)特異性表(biao)觀(guan)遺傳狀(zhuang)態，例如印(yin)跡控制區域(yu)的等位(wei)基(ji)(ji)因(yin)特異性DNA甲(jia)基(ji)(ji)化和(he)染(ran)色質(zhi)可及性狀(zhuang)態。
圖2 scNanoCOOL-seq性能驗證結果
3、技術優勢
相比(bi)較其(qi)他(ta)單細胞(bao)測序技術(shu)，scNanoCOOL-seq具有(you)以下優點(dian)：
?可(ke)以同時檢測基因組、轉錄組、染色質(zhi)可(ke)及性和DNA甲基化。
?可以(yi)檢測全長CpG島（CGIs）和基因啟動(dong)子(zi)的表觀遺傳特征。
?可以(yi)檢測具有結構變(bian)異（SVs）的基因組區域。
?可以提供在(zai)單個細胞內分(fen)析等位基因(yin)特異性表觀(guan)遺傳(chuan)狀(zhuang)態(tai)的機會。
scNanoCOOL-seq技術(shu)整合了三代測(ce)序平(ping)臺(tai)的(de)(de)(de)優勢和scCOOL-seq原(yuan)理，為(wei)科(ke)研(yan)人員提供(gong)了一種(zhong)前所(suo)未有的(de)(de)(de)單細胞多組(zu)學測(ce)序方法。這一創新性的(de)(de)(de)方法有望推動(dong)對單細胞內表觀基(ji)因組(zu)與轉錄(lu)組(zu)互動(dong)關系(xi)的(de)(de)(de)深入(ru)研(yan)究，為(wei)科(ke)學界帶來了全新的(de)(de)(de)機(ji)遇。
