人類(lei)的(de)衰(shuai)老是一(yi)個不可避(bi)免的(de)、漸進的(de)、全(quan)身性的(de)過程，其中免疫系(xi)統(tong)的(de)惡化是導致(zhi)機(ji)體走向衰(shuai)老的(de)關鍵因素(su)，免疫系(xi)統(tong)隨(sui)年齡的(de)增長而逐步退化的(de)分子證據以及(ji)導致(zhi)一(yi)些老年人保持高免疫性能而其他許多人脆(cui)弱的(de)機(ji)制，仍在進一(yi)步探(tan)索中。

老年(nian)衰(shuai)(shuai)弱(ruo)綜合征(zheng)（Frailty）是(shi)老年(nian)人生理儲備下降導致機體(ti)易損(sun)性增加、抗應激能力減退的非特異性狀(zhuang)態(tai)(tai)，是(shi)個體(ti)介(jie)于(yu)身體(ti)機能正(zheng)常到逐(zhu)步喪失進(jin)而死亡(wang)的過渡狀(zhuang)態(tai)(tai)。老年(nian)衰(shuai)(shuai)弱(ruo)綜合征(zheng)的顯著特征(zheng)之一是(shi)機體(ti)多(duo)系(xi)統的失調。免疫(yi)系(xi)統惡(e)化是(shi)衰(shuai)(shuai)弱(ruo)的關鍵標志，在衰(shuai)(shuai)弱(ruo)的病因(yin)和發病機制中起重(zhong)要作(zuo)用。

臨床問(wen)題：老年衰(shuai)弱(ruo)綜合征的免疫表型及其潛(qian)在的細胞和分(fen)子過程是什么？

前人研究(jiu)：bulk水平研究(jiu)PBMC和其(qi)它免疫細胞中(zhong)與(yu)衰老相關基因(yin)得表達變(bian)化

本研究意義：深入(ru)理解了老年衰弱綜合征中免疫衰老機制

取樣(yang)策略：取新生(sheng)兒臍帶血（n=3）、青年組PBMCs（n=3）、健康(kang)老(lao)年組PBMCs（n=6）和體弱老(lao)年組PBMCs（n=5）進行(xing)scRNA-seq+scTCR-seq

結果一：不(bu)同年齡組的免疫細胞圖譜

本研究(jiu)將獲得的(de)(de)114,467個高(gao)質量單細(xi)(xi)胞聚成17個cluster，根據經典marker基因的(de)(de)表達對cluster進行注釋(shi)（圖1b、c），發現臍帶(dai)血樣本包含非常少(shao)的(de)(de)記憶T細(xi)(xi)胞（cluster2和(he)(he)cluster3）和(he)(he)“other T cells”（cluster6和(he)(he)cluster9），這(zhe)可(ke)能意味著cluster6和(he)(he)cluster9的(de)(de)細(xi)(xi)胞處于(yu)更活(huo)躍的(de)(de)狀態或(huo)具有(you)成人特有(you)的(de)(de)T細(xi)(xi)胞特性。此外，“other T cells”的(de)(de)比例隨著樣本年齡的(de)(de)增加而逐漸(jian)上升（圖1d、e）。

圖1 同年齡(ling)組(zu)的免疫細(xi)胞圖譜

結果二：衰老過程中T細胞亞型的動態(tai)變化

本研究(jiu)提(ti)取cluster1/2/3/6/9重(zhong)新聚(ju)類(lei)分群，定義了6個(ge)亞群，如圖(tu)2f，隨著(zhu)(zhu)年(nian)(nian)(nian)齡的(de)(de)增長(chang)，T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)組(zu)(zu)成向(xiang)功能(neng)更完善的(de)(de)記憶(yi)性T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)轉移；臍帶血(xue)組(zu)(zu)T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)以Na?ve T為主，Na?ve T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)比例隨著(zhu)(zhu)年(nian)(nian)(nian)齡的(de)(de)增長(chang)而呈現出減少的(de)(de)趨勢，從青年(nian)(nian)(nian)組(zu)(zu)過渡至老(lao)(lao)(lao)年(nian)(nian)(nian)組(zu)(zu)時，Na?ve T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)數量更是急劇(ju)下降；3組(zu)(zu)成人組(zu)(zu)中，體弱老(lao)(lao)(lao)年(nian)(nian)(nian)組(zu)(zu)CD4+TCM細(xi)胞(bao)(bao)(bao)較(jiao)多(duo)，健康(kang)老(lao)(lao)(lao)年(nian)(nian)(nian)組(zu)(zu)CD8+TCM和(he)Treg細(xi)胞(bao)(bao)(bao)較(jiao)多(duo)。這(zhe)可(ke)能(neng)意味著(zhu)(zhu)CD8+和(he)CD4+T CM細(xi)胞(bao)(bao)(bao)之(zhi)間的(de)(de)平衡(heng)在維持老(lao)(lao)(lao)年(nian)(nian)(nian)人免疫系統的(de)(de)活力中起著(zhu)(zhu)重(zhong)要(yao)作用(yong)（圖(tu)2i、h）。在老(lao)(lao)(lao)年(nian)(nian)(nian)組(zu)(zu)中發現了高(gao)表(biao)達(da)長(chang)鏈(lian)非編碼RNA NEAT1和(he)MALAT1的(de)(de)T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，這(zhe)意味著(zhu)(zhu)NEAT1和(he)MALAT1可(ke)能(neng)是淋(lin)巴細(xi)胞(bao)(bao)(bao)老(lao)(lao)(lao)化的(de)(de)標志(zhi)（圖(tu)2g）。

圖2 衰(shuai)老過程中T細胞亞型的動態變化

結果三：剖析T細胞轉錄(lu)組特征與TCR動態趨勢

研究發(fa)現Na?ve T細(xi)胞(bao)(bao)發(fa)生的(de)克(ke)隆型(xing)擴增頻(pin)(pin)率較(jiao)低，相反(fan)，記憶(yi)T細(xi)胞(bao)(bao)，特別是來自(zi)老(lao)弱群(qun)體的(de)CD4+TCM細(xi)胞(bao)(bao)，具有較(jiao)高的(de)克(ke)隆型(xing)擴增頻(pin)(pin)率（圖(tu)3a）。從新(xin)生組(zu)到(dao)體弱老(lao)年組(zu)，TCR克(ke)隆多樣性逐漸(jian)降(jiang)低（圖(tu)3b）。共(gong)(gong)享(xiang)克(ke)隆型(xing)出現在(zai) CD8+ TCM, CD8+ TEM, exhausted T，CD4+ TCM 和 Treg cells中(zhong)，naiveT細(xi)胞(bao)(bao)共(gong)(gong)享(xiang)克(ke)隆型(xing)較(jiao)少(shao)（圖(tu)3c：+代表對應細(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)型(xing)間有共(gong)(gong)享(xiang)克(ke)隆型(xing)）

共享(xiang)(xiang)(xiang)的(de)(de)(de) TCR 克隆(long)型主要在(zai)成年供(gong)(gong)體中觀察到(dao)，特(te)(te)別(bie)是(shi)(shi)在(zai)old、Frail組中（圖3d）。將(jiang)共享(xiang)(xiang)(xiang)TCR序(xu)列與以前(qian)(qian)報(bao)道(dao)過的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)特(te)(te)異(yi)(yi)(yi)性TCR序(xu)列進(jin)行比對(dui)(dui)，單獨Alpha或(huo)Beta鏈(lian)匹配(pei)上的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)特(te)(te)異(yi)(yi)(yi)性TCR序(xu)列遠高于配(pei)對(dui)(dui)的(de)(de)(de)，這很可能是(shi)(shi)因為以前(qian)(qian)發(fa)現(xian)的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)特(te)(te)異(yi)(yi)(yi)性TCR大(da)多是(shi)(shi)不配(pei)對(dui)(dui)的(de)(de)(de)（圖3e）共享(xiang)(xiang)(xiang)TCR匹配(pei)到(dao)的(de)(de)(de)是(shi)(shi)CMV/EBV/IAV等抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)（圖3f）。ELISA實驗（驗證試驗）發(fa)現(xian)CMV抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)特(te)(te)異(yi)(yi)(yi)性TCRs只在(zai)old、Frail組中被鑒定出來（圖3g），部(bu)分(fen)具有CMV抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)特(te)(te)異(yi)(yi)(yi)性TCRs的(de)(de)(de)供(gong)(gong)者對(dui)(dui)CMV抗(kang)(kang)(kang)(kang)體呈陽性（圖3h）

圖3 剖析T細胞轉錄組特征與TCR動態趨勢

結果四：免(mian)疫細胞異質性以及共(gong)同的衰(shuai)老特征

隨(sui)著(zhu)年齡的(de)(de)(de)(de)增(zeng)長，16種細胞(bao)類(lei)型中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)大多數細胞(bao)亞群表現(xian)出(chu)更加(jia)多樣化的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄特(te)征（圖(tu)4a），推測血(xue)液中(zhong)(zhong)免(mian)疫細胞(bao)存在(zai)異(yi)(yi)質性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)原因可能與隨(sui)著(zhu)年齡增(zeng)長不斷暴露的(de)(de)(de)(de)細胞(bao)外抗(kang)原增(zeng)加(jia)有關。通(tong)過組(zu)(zu)間差異(yi)(yi)分(fen)析找(zhao)組(zu)(zu)特(te)異(yi)(yi)性(xing)(xing)基因，再看組(zu)(zu)特(te)異(yi)(yi)性(xing)(xing)基因在(zai)細胞(bao)亞群的(de)(de)(de)(de)表達情況，有無(wu)(wu)細胞(bao)類(lei)型偏好(hao)，發(fa)現(xian)年輕(qing)組(zu)(zu)幾(ji)乎無(wu)(wu)細胞(bao)類(lei)型偏好(hao)（圖(tu)4c）。功(gong)能富集(ji)分(fen)析發(fa)現(xian)例如臍帶血(xue)特(te)異(yi)(yi)性(xing)(xing)基因(如SOX4、FCER1G和STMN1)集(ji)中(zhong)(zhong)在(zai)T細胞(bao)亞型中(zhong)(zhong)，這(zhe)些基因在(zai)淋巴細胞(bao)激活和分(fen)化功(gong)能中(zhong)(zhong)富集(ji)（圖(tu)4d、e）。最后通(tong)過Qpcr驗(yan)證特(te)異(yi)(yi)性(xing)(xing)基因表達（圖(tu)4f）。

圖4 免疫細胞異質性以及共同的衰老特征

結果五：特定年齡組和特定細(xi)胞類型的轉錄調(diao)控分析

分(fen)(fen)析發現大多展(zhan)示的是不同(tong)分(fen)(fen)組中某一種細胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)特(te)有(you)(you)的regulon（圖(tu)5a），調控網(wang)絡圖(tu)展(zhan)示大多數靶(ba)基(ji)(ji)因(yin)都(dou)被一個轉(zhuan)錄因(yin)子專(zhuan)一靶(ba)向(xiang)(xiang)，表明所識別的regulon具有(you)(you)較(jiao)高的特(te)異性(xing)（圖(tu)5b）。通(tong)過比較(jiao)靶(ba)基(ji)(ji)因(yin)在(zai)不同(tong)分(fen)(fen)組、不同(tong)細胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)的表達水(shui)平，TF可能起到正(zheng)向(xiang)(xiang)或(huo)負(fu)向(xiang)(xiang)調節作(zuo)用(yong)。例(li)如， Krüppel-like family 的KLF2（源于新生(sheng)兒臍帶血組和體弱老年組的NK細胞(bao)(bao)）和KLF6（源于健(jian)康老年組的NK細胞(bao)(bao)）對靶(ba)基(ji)(ji)因(yin)是正(zheng)向(xiang)(xiang)調節作(zuo)用(yong)，而KLF3 （源于青(qing)年組的T細胞(bao)(bao)）對靶(ba)基(ji)(ji)因(yin)是負(fu)向(xiang)(xiang)調節作(zuo)用(yong)，與先前已(yi)知的Krüppel-like factors的功能是一致(zhi)的（圖(tu)5d）。

圖5 特定年齡組和特定細胞類型的轉錄調控分析

結果六(liu)：不同(tong)細胞類型(xing)的免疫(yi)衰(shuai)老軌跡（以naiveT細胞為例）

擬時(shi)軌跡(ji)分(fen)析(xi)描繪了來(lai)(lai)(lai)(lai)自(zi)不同年(nian)齡組的naiveT細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)沿著假時(shi)間尺度的遞增，來(lai)(lai)(lai)(lai)自(zi)臍(qi)帶血的細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)主要聚集在早期末端，而來(lai)(lai)(lai)(lai)自(zi)三個(ge)成年(nian)組的細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)位于2個(ge)分(fen)支上(shang)（圖(tu)(tu)6ab），SOX4基因（與(yu)T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)分(fen)化(hua)與(yu)遷移相關(guan)）在主要來(lai)(lai)(lai)(lai)自(zi)臍(qi)帶血的naiveT細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中高表(biao)達（圖(tu)(tu)6d），可定為(wei)生(sheng)物學起點(dian)。部分(fen)核糖體蛋白編碼基因表(biao)現(xian)出選擇(ze)性表(biao)達特征，RPS24、RPS29、RPS12和(he)RPS14在早、中晚期互斥表(biao)達（圖(tu)(tu)6c），對(dui)Late1和(he)Late2（圖(tu)(tu)6e）差異(yi)(yi)基因分(fen)析(xi)發現(xian)old組上(shang)調差異(yi)(yi)基因涉及Toll-like receptor and MAPK signaling pathways（DUSP1, FOS, JUN和(he)NFKB2），Frail組上(shang)調差異(yi)(yi)基因涉及病(bing)毒(du)反(fan)應和(he)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)凋亡（DDIT3和(he)MX1），推測(ce)來(lai)(lai)(lai)(lai)自(zi)old組的naive T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)在功能上(shang)比來(lai)(lai)(lai)(lai)自(zi)Frail組的naive T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)更活躍。

圖6  naiveT細胞的免疫衰老軌跡分析

結果七：體弱老年組(zu)特異性(xing)的單(dan)核細胞亞(ya)群（Frailty-specific monocytes）分析(xi)

提取cluster4/10/12重(zhong)新聚類分群(qun)，發現一(yi)群(qun)Frailty-specific monocytes（圖(tu)(tu)7a），lncRNAs NEAT1 和(he)(he)(he)(he) MALAT1，與(yu)(yu)癌癥(zheng)和(he)(he)(he)(he)全基(ji)(ji)因(yin)組基(ji)(ji)因(yin)調(diao)控(kong)功(gong)(gong)能(neng)有關(guan)(guan)而(er)廣為人知，而(er)Frailty-specific monocytes高表(biao)(biao)達該(gai)基(ji)(ji)因(yin)（圖(tu)(tu)7b），Frailty-specific monocytes 和(he)(he)(he)(he)其它類型單核(he)細(xi)胞(bao)(bao)差異分析和(he)(he)(he)(he)功(gong)(gong)能(neng)富集分析發現上調(diao)基(ji)(ji)因(yin)富集到與(yu)(yu)炎(yan)癥(zheng)反應和(he)(he)(he)(he)衰(shuai)老(lao)有關(guan)(guan)的(de)(de)(de)功(gong)(gong)能(neng)，下調(diao)基(ji)(ji)因(yin)富集到對胞(bao)(bao)吐(tu)、髓(sui)系細(xi)胞(bao)(bao)活(huo)(huo)化和(he)(he)(he)(he)細(xi)胞(bao)(bao)凋亡具有重(zhong)要作(zuo)(zuo)用(yong)的(de)(de)(de)功(gong)(gong)能(neng)（圖(tu)(tu)7d）。前人報道NEAT1 是髓(sui)系細(xi)胞(bao)(bao)（包括單核(he)細(xi)胞(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)巨噬細(xi)胞(bao)(bao)）中的(de)(de)(de)炎(yan)癥(zheng)激活(huo)(huo)劑，通過(guo)NEAT1基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)過(guo)表(biao)(biao)達來探(tan)索NEAT1與(yu)(yu)細(xi)胞(bao)(bao)衰(shuai)老(lao)的(de)(de)(de)關(guan)(guan)系，首先確定(ding)了NEAT1、IL1B 和(he)(he)(he)(he) IL6 以及一(yi)系列細(xi)胞(bao)(bao)衰(shuai)老(lao)標記基(ji)(ji)因(yin)CDKN1A、CDKN2A 和(he)(he)(he)(he) SIRT1的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達（圖(tu)(tu)7e），接下來，NEAT1 的(de)(de)(de)過(guo)表(biao)(biao)達顯(xian)著增加了炎(yan)癥(zheng)反應（IL1B、IL6 和(he)(he)(he)(he) IL8）和(he)(he)(he)(he)細(xi)胞(bao)(bao)衰(shuai)老(lao)（CDKN2A、CDKN1A、SIRT1 和(he)(he)(he)(he) β-半乳糖苷酶）標志(zhi)物的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達（圖(tu)(tu)7f-i），故可推測 NEAT1基(ji)(ji)因(yin)促(cu)進(jin)衰(shuai)老(lao)單核(he)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)炎(yan)癥(zheng)反應，進(jin)而(er)導(dao)致虛弱(ruo)。MAFB 和(he)(he)(he)(he) RELB 在脆(cui)弱(ruo)的(de)(de)(de)單核(he)細(xi)胞(bao)(bao)中均(jun)表(biao)(biao)現出相對較高的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達水(shui)平(ping)，而(er)脆(cui)弱(ruo)的(de)(de)(de)單核(he)細(xi)胞(bao)(bao)具有適度高的(de)(de)(de) MAFB 和(he)(he)(he)(he) RELB 調(diao)節(jie)子(zi)活(huo)(huo)性，這表(biao)(biao)明 RELB 作(zuo)(zuo)為潛在的(de)(de)(de)主要調(diao)節(jie)因(yin)子(zi)導(dao)致脆(cui)弱(ruo)的(de)(de)(de)單核(he)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)性質受(shou)損（圖(tu)(tu)7j、k）。

圖7  體弱老年組特異性的單核細胞亞群分析

本(ben)研究構建了(le)從新(xin)生兒到衰弱的(de)(de)人類免(mian)疫細胞單(dan)細胞水平的(de)(de)轉錄組譜圖和TCR克隆(long)型(xing)圖譜。為發現(xian)免(mian)疫衰老和衰弱的(de)(de)新(xin)細胞類型(xing)、特異(yi)性細胞標記和全球基因組資源(yuan)提供了(le)見解，有助于我們解釋衰弱的(de)(de)發病(bing)機制(zhi)。