2023-10-25
細胞純化分離
密度梯度篇
單細(xi)胞(bao)(bao)測(ce)(ce)序技術受到(dao)越來越多關注，正是因(yin)為其與傳統的(de)(de)(de)轉錄(lu)組測(ce)(ce)序不同，單細(xi)胞(bao)(bao)測(ce)(ce)序技術能(neng)夠(gou)通過對(dui)單個細(xi)胞(bao)(bao)進行(xing)(xing)分(fen)(fen)析(xi)比較(jiao)，從而得(de)(de)到(dao)混雜樣品測(ce)(ce)序所無法(fa)得(de)(de)到(dao)的(de)(de)(de)異質性(xing)信息，發現(xian)新的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)類型、研究生(sheng)(sheng)物體的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)發育及(ji)調控機(ji)制(zhi)(zhi)。在單細(xi)胞(bao)(bao)（核(he)(he)）測(ce)(ce)序技術中，最重要(yao)的(de)(de)(de)一環就是細(xi)胞(bao)(bao)（核(he)(he)）懸液的(de)(de)(de)制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)，只有制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)得(de)(de)到(dao)純度高、細(xi)胞(bao)(bao)（核(he)(he)）完整性(xing)好的(de)(de)(de)懸液，才(cai)能(neng)保證后續(xu)實驗的(de)(de)(de)順利進行(xing)(xing)得(de)(de)到(dao)有效數據以供后續(xu)生(sheng)(sheng)信分(fen)(fen)析(xi)。如何才(cai)能(neng)獲得(de)(de)高質量懸液呢？相(xiang)較(jiao)于利用儀器設備(bei)(bei)進行(xing)(xing)分(fen)(fen)選，目(mu)前應(ying)用廣泛(fan)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)分(fen)(fen)離純化(hua)方法(fa)為利用密(mi)度梯度介(jie)質進行(xing)(xing)密(mi)度梯度離心。
密(mi)(mi)度(du)(du)(du)(du)梯(ti)(ti)度(du)(du)(du)(du)離(li)心技術(shu)可(ke)根據粒(li)子大(da)小、形狀(zhuang)和密(mi)(mi)度(du)(du)(du)(du)進行分(fen)(fen)離(li)，通常通過在離(li)心管中(zhong)隨密(mi)(mi)度(du)(du)(du)(du)分(fen)(fen)層，形成(cheng)密(mi)(mi)度(du)(du)(du)(du)梯(ti)(ti)度(du)(du)(du)(du)。當樣品在密(mi)(mi)度(du)(du)(du)(du)梯(ti)(ti)度(du)(du)(du)(du)上(shang)分(fen)(fen)層并離(li)心時(shi)，各種(zhong)粒(li)子以不(bu)同(tong)的(de)速率通過梯(ti)(ti)度(du)(du)(du)(du)。粒(li)子在梯(ti)(ti)度(du)(du)(du)(du)中(zhong)呈現帶狀(zhuang)；密(mi)(mi)度(du)(du)(du)(du)越大(da)、粒(li)子越大(da)，遷移的(de)越遠。不(bu)同(tong)的(de)密(mi)(mi)度(du)(du)(du)(du)梯(ti)(ti)度(du)(du)(du)(du)介(jie)質(zhi)不(bu)僅(jin)可(ke)以純(chun)化細(xi)(xi)胞(bao)（核）除去懸(xuan)液中(zhong)雜(za)質(zhi)，還可(ke)以同(tong)時(shi)從組分(fen)(fen)中(zhong)分(fen)(fen)離(li)所需不(bu)同(tong)細(xi)(xi)胞(bao)類型、富集外泌(mi)體、病毒等。接下(xia)來給(gei)大(da)家詳細(xi)(xi)介(jie)紹常用(yong)(yong)介(jie)質(zhi)的(de)特點以及應用(yong)(yong)范圍(wei)。
PART 01
蔗糖
蔗糖(tang)水溶(rong)性大，性質穩定，滲透壓(ya)較(jiao)高(gao)(gao)，其最高(gao)(gao)密度可達1.33g/ml，常(chang)用(yong)于細(xi)(xi)胞器(qi)、病毒、RNA分離(li)，但由于有(you)較(jiao)大的滲透壓(ya)，不宜用(yong)于細(xi)(xi)胞的分離(li)。
蔗糖梯度離心法分離葉綠體DNA流程圖[1]
PART 02
Ficoll
Ficoll 是蔗糖的(de)多(duo)聚體，中(zhong)性，平均(jun)分(fen)子量(liang)400000，當密度(du)為1.2g/mL，未超出正常(chang)生理(li)性滲透(tou)壓(ya)，也不穿過(guo)生物膜，可以分(fen)離特(te)定密度(du)細胞(bao)(bao)(bao)的(de)分(fen)離液，適于已知密度(du)細胞(bao)(bao)(bao)的(de)分(fen)離，常(chang)被用作從外周血(xue)、骨(gu)髓及臍帶血(xue)中(zhong)分(fen)離高活性的(de)單(dan)個核細胞(bao)(bao)(bao)（包括(kuo)淋巴細胞(bao)(bao)(bao)和單(dan)核細胞(bao)(bao)(bao)）。
Ficoll根據細(xi)胞(bao)密(mi)度(du)(du)(du)的(de)不同進行分(fen)(fen)(fen)離(li)，單(dan)(dan)個核細(xi)胞(bao)的(de)體積、形狀和(he)(he)(he)比重與(yu)其他(ta)細(xi)胞(bao)不同，紅細(xi)胞(bao)和(he)(he)(he)多核白細(xi)胞(bao)比重較(jiao)大(da)，為(wei) 1.092 左右(you)，淋巴細(xi)胞(bao)和(he)(he)(he)單(dan)(dan)個核細(xi)胞(bao)比重為(wei) 1.075 左右(you)。利用 Ficoll 作密(mi)度(du)(du)(du)梯度(du)(du)(du)離(li)心時，各種(zhong)血(xue)液(ye)成分(fen)(fen)(fen)將(jiang)按密(mi)度(du)(du)(du)梯度(du)(du)(du)重新(xin)分(fen)(fen)(fen)布(bu)聚集(ji)：血(xue)漿和(he)(he)(he)血(xue)小板密(mi)度(du)(du)(du)較(jiao)低,，懸浮于分(fen)(fen)(fen)離(li)液(ye)的(de)上部；紅細(xi)胞(bao)與(yu)粒細(xi)胞(bao)密(mi)度(du)(du)(du)較(jiao)大(da)，沉于分(fen)(fen)(fen)離(li)液(ye)的(de)底部；PBMC 密(mi)度(du)(du)(du)稍低于分(fen)(fen)(fen)離(li)液(ye)，位(wei)于分(fen)(fen)(fen)離(li)液(ye)界面之(zhi)上。
Ficoll梯度離心法分離成年小鼠背部皮膚毛囊間充質干細胞[2]
PART 03
Percoll
Percoll是(shi)帶有不(bu)(bu)可(ke)透(tou)析的(de)聚(ju)乙烯吡咯烷酮(tong) (PVP) 涂(tu)層的(de)二氧化(hua)(hua)硅(gui)溶膠，可(ke)形成的(de)梯度范(fan)圍是(shi)1.0 g/mL-1.3 g/mL。Percoll分離液不(bu)(bu)穿透(tou)生(sheng)物(wu)膜(mo)，對細胞無(wu)毒無(wu)害，因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒等。Percoll也(ye)常用于分離和純化(hua)(hua)植(zhi)物(wu)原生(sheng)質體(ti)(ti)、核、葉綠體(ti)(ti)、線粒(li)體(ti)(ti)。
Percoll是(shi)一(yi)(yi)種低(di)粘度且(qie)密度穩(wen)定的(de)(de)(de)(de)膠體，由于(yu)顆粒大(da)小的(de)(de)(de)(de)異質(zhi)化，離心(xin)過程以(yi)不同的(de)(de)(de)(de)速(su)率(lv)沉(chen)淀，自發(fa)產生一(yi)(yi)個勻質(zhi)化且(qie)等滲(shen)的(de)(de)(de)(de)梯度，密度在1.0-1.3 g/mL之間。大(da)部分沉(chen)淀系數＞60S的(de)(de)(de)(de)生物顆粒都可以(yi)用(yong)Percoll實(shi)現分離。（Percoll原(yuan)液是(shi)低(di)滲(shen)的(de)(de)(de)(de)，需(xu)先用(yong)10倍的(de)(de)(de)(de)高滲(shen)溶液和Percoll原(yuan)液以(yi)1:9的(de)(de)(de)(de)比例配成(cheng)等滲(shen)的(de)(de)(de)(de)Stock Isotonic Percoll，第二步再將SIP稀釋(shi)到所需(xu)的(de)(de)(de)(de)目標密度。）
Percoll梯度離心法分離純化葉綠體[3]
PART 04
OptiPrep?分離液
OptiPrep?主要(yao)成分是60%碘克沙醇，是一種高親水性(xing)的非離子物質，密(mi)度為1.32 g/ml，可以用(yong)來(lai)分離多種細胞、病(bing)毒、蛋(dan)白(bai)質、核酸等不(bu)同顆(ke)粒。OptiPrep不(bu)含多糖，對細胞基本無毒，能直接進行后續實(shi)驗。
OptiPrep?分(fen)離(li)(li)液(ye)利(li)用(yong)緩沖液(ye)將(jiang)碘克沙醇稀釋到(dao)不(bu)同濃度(du)(du)(du)，不(bu)同濃度(du)(du)(du)溶液(ye)具有不(bu)同密(mi)(mi)度(du)(du)(du)。利(li)用(yong)不(bu)同顆粒之(zhi)間存在(zai)沉(chen)降系數(shu)差，在(zai)一定(ding)離(li)(li)心(xin)力作用(yong)下(xia)，顆粒各自以一定(ding)速(su)度(du)(du)(du)沉(chen)降，會在(zai)密(mi)(mi)度(du)(du)(du)梯度(du)(du)(du)區(qu)(qu)域上(shang)形成不(bu)同區(qu)(qu)帶，從而起到(dao)純化的目(mu)的。
碘克沙醇梯度離心法分離純化衰老細胞[4]
PART 05
不同密度梯度介質對比
[1]Takamatsu T, Baslam M, Inomata T, Oikawa K, Itoh K, Ohnishi T, Kinoshita T and Mitsui T (2018) Optimized Method of Extracting Rice Chloroplast DNA for High-Quality Plastome Resequencing and de Novo Assembly. Front. Plant Sci. 9:266. doi: 10.3389/fpls.2018.00266.
[2]Gan, Y., Wang, H., Du, L. et al. Ficoll density gradient sedimentation isolation of pelage hair follicle mesenchymal stem cells from adult mouse back skin: a novel method for hair follicle mesenchymal stem cells isolation. Stem Cell Res Ther 13, 372 (2022). //doi.org/10.1186/s13287-022-03051-3.
[3]Bhattacharya, O., Ortiz, I. & Walling, L.L. Methodology: an optimized, high-yield tomato leaf chloroplast isolation and stroma extraction protocol for proteomics analyses and identification of chloroplast co-localizing proteins. Plant Methods 16, 131 (2020). //doi.org/10.1186/s13007-020-00667-5.
[4]Kovacovicova Kristina;Vinciguerra Manlio(2019)Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation.Cell proliferation. Volume 52 , Issue 6 . 2019. PP e12674. //doi.org/10.1111/cpr.12674
