胰(yi)(yi)腺是(shi)(shi)人體(ti)重(zhong)要(yao)的(de)(de)消化(hua)(hua)和(he)(he)內(nei)分(fen)泌(mi)(mi)器官(guan)，主要(yao)負責體(ti)內(nei)營養(yang)物(wu)質的(de)(de)代謝(xie)。99%的(de)(de)胰(yi)(yi)腺上皮由外(wai)分(fen)泌(mi)(mi)組(zu)織組(zu)成(cheng)，包(bao)括分(fen)泌(mi)(mi)消化(hua)(hua)酶(mei)(mei)的(de)(de)腺泡細胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)將這(zhe)些(xie)酶(mei)(mei)運(yun)輸到腸(chang)道的(de)(de)導管細胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)。其余1%為(wei)內(nei)分(fen)泌(mi)(mi)組(zu)織，又稱朗格漢斯胰(yi)(yi)島，由α/β/δ/PP/ε細胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)等5種(zhong)不(bu)同的(de)(de)內(nei)分(fen)泌(mi)(mi)細胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)組(zu)成(cheng)，主要(yao)負責調節葡萄糖(tang)穩態。這(zhe)些(xie)細胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)功能障礙導致各種(zhong)疾病，如胰(yi)(yi)腺炎、胰(yi)(yi)腺癌和(he)(he)糖(tang)尿病。了解胰(yi)(yi)腺的(de)(de)胚胎發育，特別是(shi)(shi)細胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)命(ming)運(yun)決定和(he)(he)內(nei)分(fen)泌(mi)(mi)細胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)分(fen)化(hua)(hua)，有(you)助于(yu)改進從(cong)人多(duo)能干細胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)（hPSC）體(ti)外(wai)分(fen)化(hua)(hua)生成(cheng)胰(yi)(yi)腺細胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)方(fang)案(an)。

得益于(yu)強大的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)遺傳工具(ju)和(he)(he)動物模型(xing)，先前(qian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究揭示了嚙(nie)齒動物胰(yi)(yi)(yi)(yi)腺(xian)器官發生的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)重(zhong)要分(fen)(fen)子事件(jian)。胰(yi)(yi)(yi)(yi)腺(xian)起源(yuan)于(yu)背側和(he)(he)腹側內胚(pei)層區域，它們接受(shou)來自相鄰組(zu)織的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)不同(tong)(tong)信號。這一(yi)(yi)過程在小(xiao)鼠(shu)胚(pei)胎(tai)第(di)8.5天和(he)(he)人類受(shou)孕后27-29天開始。腹側胰(yi)(yi)(yi)(yi)腺(xian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)出現(xian)晚于(yu)背側胰(yi)(yi)(yi)(yi)腺(xian)，它與肝(gan)臟和(he)(he)肝(gan)外膽管(guan)(EHBD)具(ju)有共同(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)祖(zu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)。兩個(ge)(ge)胰(yi)(yi)(yi)(yi)芽含有多(duo)能(neng)(neng)祖(zu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（MP, multipotent progenitor），可(ke)以分(fen)(fen)化(hua)(hua)成(cheng)(cheng)胰(yi)(yi)(yi)(yi)腺(xian)上皮(pi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)所有譜系細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，并最終由于(yu)腸管(guan)旋轉而融合形成(cheng)(cheng)單個(ge)(ge)器官。細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)增殖(zhi)擴大胰(yi)(yi)(yi)(yi)腺(xian)上皮(pi)并重(zhong)塑其形成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)支管(guan)狀結構。同(tong)(tong)時，MP細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)發育(yu)為(wei)尖(jian)端細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（tip cells）和(he)(he)主干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（trunk cells），尖(jian)端細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)有可(ke)能(neng)(neng)進(jin)一(yi)(yi)步分(fen)(fen)化(hua)(hua)成(cheng)(cheng)腺(xian)泡(pao)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（acinar cells），而主干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)具(ju)有雙向分(fen)(fen)化(hua)(hua)為(wei)內分(fen)(fen)泌(mi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（endocrine cells）和(he)(he)導管(guan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（ductal cells）的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)能(neng)(neng)力。兩種轉錄(lu)因子(TFs)，促進(jin)尖(jian)端命(ming)運的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)PTF1A和(he)(he)誘導主干(gan)(gan)命(ming)運的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)NKX6-1是這一(yi)(yi)過程的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)主要調控因子。內分(fen)(fen)泌(mi)祖(zu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(Endocrine progenitor, EP)受(shou)NEUROG3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)調控，從主干(gan)(gan)結構域分(fen)(fen)層分(fen)(fen)化(hua)(hua)為(wei)內分(fen)(fen)泌(mi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)。受(shou)MAFA等特定因子調控的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)β細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)成(cheng)(cheng)熟是一(yi)(yi)個(ge)(ge)漫長的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)過程。雖然已(yi)經根(gen)據(ju)小(xiao)鼠(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究得出了許多(duo)關于(yu)胰(yi)(yi)(yi)(yi)腺(xian)發育(yu)和(he)(he)體外分(fen)(fen)化(hua)(hua)方(fang)案的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)結論(lun)，但已(yi)經發現(xian)到人類和(he)(he)小(xiao)鼠(shu)之間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)存在著物種差異。例如(ru)，小(xiao)鼠(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)內分(fen)(fen)泌(mi)分(fen)(fen)化(hua)(hua)有兩個(ge)(ge)高峰，而人類只有一(yi)(yi)個(ge)(ge)階(jie)段。

單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)轉錄組(zu)(zu)測(ce)序(xu)(scRNA-seq)和(he)單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)染色質(zhi)可(ke)及性測(ce)序(xu)(scATAC-seq)是研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)發育(yu)(yu)生(sheng)物(wu)學的(de)(de)(de)(de)有(you)力工具(ju)。近(jin)期(qi)(qi)對小鼠和(he)人類(lei)的(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)揭示(shi)了(le)單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)分(fen)(fen)(fen)辨(bian)率下胎(tai)兒胰(yi)(yi)腺組(zu)(zu)織的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)組(zu)(zu)成、分(fen)(fen)(fen)子異(yi)質(zhi)性和(he)分(fen)(fen)(fen)化發育(yu)(yu)軌跡(ji)。然(ran)而，由于人類(lei)胚(pei)胎(tai)樣本的(de)(de)(de)(de)稀缺和(he)從早(zao)期(qi)(qi)胚(pei)胎(tai)分(fen)(fen)(fen)離胰(yi)(yi)腺的(de)(de)(de)(de)困(kun)難，對人類(lei)早(zao)期(qi)(qi)胰(yi)(yi)腺發育(yu)(yu)的(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)子特(te)征和(he)調控網絡(luo)知之甚少，特(te)別是在受孕后8周(zhou)之前。本研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)對PCW 4-11收集的(de)(de)(de)(de)人胚(pei)胎(tai)胰(yi)(yi)腺組(zu)(zu)織進行(xing)了(le)scRNA-seq，并對PCW 8-11收集的(de)(de)(de)(de)人胚(pei)胎(tai)胰(yi)(yi)腺組(zu)(zu)織進行(xing)了(le)scATAC-seq，研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)數據描繪了(le)單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)水平(ping)妊娠早(zao)期(qi)(qi)（PCW 4-11）胰(yi)(yi)腺器官發生(sheng)的(de)(de)(de)(de)整個軌跡(ji)。

本研(yan)究對從(cong)PCW 4至11的8個(ge)時(shi)間點(dian)的17名捐贈者(zhe)（包括6名男(nan)性和11名女性）收(shou)集(ji)的人類(lei)胚胎胰腺組織進(jin)行(xing)了scRNA-seq（圖1a），共(gong)得到(dao)68714個(ge)高質量單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)，注釋出6種(zhong)主要(yao)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)類(lei)型，包括上皮細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(EPCAM+)、間充(chong)(chong)質細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(COL3A1+)、內皮細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(PECAM1+)、神經細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(ASCL1+)、免(mian)疫細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(PTPRC+)和紅系細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(HBA1+)（圖1d、1f），從(cong)PCW 7到(dao)11，間充(chong)(chong)質細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)的比(bi)例逐漸下降，上皮細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)和其他類(lei)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)的比(bi)例增加（圖1i）。

圖1 實驗設計和細胞圖譜展示

上(shang)(shang)皮細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)是(shi)(shi)胰(yi)腺(xian)(xian)的(de)(de)(de)(de)主(zhu)要組成(cheng)部分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)，執行胰(yi)腺(xian)(xian)的(de)(de)(de)(de)基本功能。本研究根據上(shang)(shang)皮細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)經典marker基因（EPCAM和(he)(he)(he)PDX1）的(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)，共鑒定了(le)(le)(le)13個cluster，它們(men)代表(biao)了(le)(le)(le)胰(yi)腺(xian)(xian)早期(qi)發育(yu)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)所有上(shang)(shang)皮細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)譜系（圖(tu)2b）。研究發現MP細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)僅存在(zai)(zai)(zai)(zai)于PCW 4和(he)(he)(he)5中(zhong)，在(zai)(zai)(zai)(zai)此(ci)階段其數量存在(zai)(zai)(zai)(zai)逐(zhu)漸減少的(de)(de)(de)(de)趨勢(shi)。從PCW 4到PCW 7，早期(qi)尖(jian)端（early tip cells）和(he)(he)(he)早期(qi)主(zhu)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（early trunk cells）數量逐(zhu)漸增加(jia)。PCW10后(hou)出現導管細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)腺(xian)(xian)泡(pao)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，PCW8后(hou)產生大(da)量內分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)泌(mi)祖細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（EP endocrine progenitor）和(he)(he)(he)內分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)泌(mi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（endocrine cells）（圖(tu)2c）。此(ci)外，文(wen)章利用熱(re)圖(tu)展示每個亞型top100的(de)(de)(de)(de)差異基因，并標注了(le)(le)(le)關鍵的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄因子（圖(tu)2d）。一(yi)些內分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)泌(mi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)表(biao)達(da)高水平(ping)的(de)(de)(de)(de)內分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)泌(mi)激素，EP細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)表(biao)達(da)高水平(ping)的(de)(de)(de)(de)NEUROG3，胰(yi)腺(xian)(xian)上(shang)(shang)皮細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)內分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)泌(mi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)數量在(zai)(zai)(zai)(zai)PCW 4中(zhong)可(ke)以忽(hu)略(lve)不(bu)計，在(zai)(zai)(zai)(zai)PCW 5-7中(zhong)消失，而在(zai)(zai)(zai)(zai)PCW 8后(hou)逐(zhu)漸增加(jia)，在(zai)(zai)(zai)(zai)PCW 10和(he)(he)(he)11時達(da)到峰值，提示胰(yi)腺(xian)(xian)上(shang)(shang)皮細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)在(zai)(zai)(zai)(zai)PCW 8后(hou)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)化(hua)(hua)形成(cheng)了(le)(le)(le)大(da)量的(de)(de)(de)(de)內分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)泌(mi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。故接下來利用Monocle3構建了(le)(le)(le)腺(xian)(xian)泡(pao)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、導管細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)內分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)泌(mi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)發育(yu)軌跡(ji)證實了(le)(le)(le)推測（圖(tu)2f），即背側(ce)和(he)(he)(he)腹側(ce)的(de)(de)(de)(de)MP細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)化(hua)(hua)為早期(qi)尖(jian)端細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)主(zhu)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。然(ran)后(hou)，早期(qi)尖(jian)端細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)發育(yu)成(cheng)尖(jian)端細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)腺(xian)(xian)泡(pao)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，而早期(qi)主(zhu)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)則(ze)發育(yu)成(cheng)主(zhu)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)導管細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。主(zhu)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)是(shi)(shi)雙潛能細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，可(ke)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)化(hua)(hua)成(cheng)EP細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)導管細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。

本研究對背(bei)側(ce)(ce)(ce)和腹(fu)(fu)側(ce)(ce)(ce)MP進行差異分析和功能富集(ji)分析，結果表(biao)明(ming)背(bei)側(ce)(ce)(ce)MP細胞(bao)(bao)與Wnt信(xin)(xin)號傳(chuan)導、細胞(bao)(bao)連接組裝(zhuang)和突觸組織有關，而腹(fu)(fu)側(ce)(ce)(ce)MP細胞(bao)(bao)則與核糖體組裝(zhuang)、肌(ji)肉組織發(fa)育和成肌(ji)細胞(bao)(bao)分化有關（圖3a、3b）。背(bei)側(ce)(ce)(ce)和腹(fu)(fu)側(ce)(ce)(ce)MP細胞(bao)(bao)都表(biao)達了常見的(de)胰腺(xian)標記物，如PDX1、PTF1A 和 NKX6-1（圖3c），Wnt信(xin)(xin)號傳(chuan)導相關的(de)基因（GPC3, FRZB, FZD5 和LYPD6）在背(bei)側(ce)(ce)(ce)MP細胞(bao)(bao)中高(gao)表(biao)達，而BMP信(xin)(xin)號傳(chuan)導靶向TF（ID1、ID2和ID3）在腹(fu)(fu)側(ce)(ce)(ce)MP細胞(bao)(bao)中高(gao)表(biao)達（圖3c）。這些結果表(biao)明(ming)，背(bei)側(ce)(ce)(ce)和腹(fu)(fu)側(ce)(ce)(ce)MP細胞(bao)(bao)在發(fa)育過程中接收到了不(bu)同的(de)信(xin)(xin)號。

為了解析(xi)驅(qu)動(dong)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞命運分(fen)(fen)化和(he)(he)每個胰腺(xian)(xian)譜(pu)(pu)系(xi)持(chi)續分(fen)(fen)化的(de)潛在基因調控過程，本(ben)研(yan)究對PCW 8-11的(de)人類胚(pei)胎胰腺(xian)(xian)組織進行(xing)了scATAC-seq分(fen)(fen)析(xi)（圖(tu)4a），共(gong)獲(huo)得12288個高質量單細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞，鑒定出腺(xian)(xian)泡、導管以及(ji)內分(fen)(fen)泌(mi)譜(pu)(pu)系(xi)中(zhong)的(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞類型(xing)，與(yu)(yu)scRNA-seq結果一致(zhi)（圖(tu)4b）。此外，本(ben)研(yan)究發(fa)(fa)現腺(xian)(xian)泡細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞、導管細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞、EP和(he)(he)內分(fen)(fen)泌(mi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞，在scATAC-seq數據中(zhong)比在scRNA-seq中(zhong)更(geng)早(zao)被(bei)識別出來，相應的(de)標志區域似(si)乎比mRNA更(geng)早(zao)被(bei)檢(jian)測(ce)到(dao)，反(fan)應了在基因表達之(zhi)前就已發(fa)(fa)生了基因調控（圖(tu)4c）。擬(ni)時序分(fen)(fen)析(xi)發(fa)(fa)現，與(yu)(yu)在scRNA-seq中(zhong)觀察到(dao)的(de)軌跡相似(si)，反(fan)映了scRNA-seq和(he)(he)scATAC-seq圖(tu)譜(pu)(pu)之(zhi)間的(de)高度(du)一致(zhi)性（圖(tu)4d）。進一步比較細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞類型(xing)特(te)異性peak以及(ji)對應基因的(de)表達譜(pu)(pu)，發(fa)(fa)現在成熟的(de)腺(xian)(xian)泡細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞和(he)(he)內分(fen)(fen)泌(mi)譜(pu)(pu)系(xi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞中(zhong)有更(geng)明(ming)顯的(de)peak，這可能與(yu)(yu)其(qi)相對成熟的(de)特(te)性和(he)(he)逐漸獲(huo)得更(geng)復雜的(de)功能相關（圖(tu)4e）。

胰腺(xian)上皮(pi)(pi)的(de)(de)(de)(de)(de)主(zhu)(zhu)(zhu)要(yao)(yao)(yao)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)群由腺(xian)泡（尖端(duan)(duan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)）和(he)(he)(he)(he)導(dao)管（主(zhu)(zhu)(zhu)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)）譜系組成(cheng)(cheng)，為了(le)探(tan)索這(zhe)兩個譜系的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)命運決(jue)定(ding)，本(ben)研究比較了(le)它們的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)模式(shi)(shi)，發現(xian)HES4和(he)(he)(he)(he)RBPJL在(zai)(zai)(zai)早期尖端(duan)(duan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)早期主(zhu)(zhu)(zhu)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)存(cun)在(zai)(zai)(zai)差異（圖(tu)(tu)(tu)5a），以熱(re)圖(tu)(tu)(tu)的(de)(de)(de)(de)(de)形式(shi)(shi)展(zhan)示了(le)尖端(duan)(duan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)主(zhu)(zhu)(zhu)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中不同分化(hua)方向(xiang)分支(zhi)(zhi)基(ji)(ji)因的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)，并突(tu)出(chu)了(le)TF（圖(tu)(tu)(tu)5b）。分支(zhi)(zhi)基(ji)(ji)因的(de)(de)(de)(de)(de)GO功能富集分析發現(xian)主(zhu)(zhu)(zhu)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)導(dao)管細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)激(ji)活了(le)Notch、Wnt、MAPK通(tong)(tong)(tong)(tong)路、肌動蛋白、細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)連接和(he)(he)(he)(he)神(shen)經系統發育，而金(jin)屬離子穩態(tai)、肽酶(mei)活性、消(xiao)化(hua)和(he)(he)(he)(he)內在(zai)(zai)(zai)凋(diao)亡信(xin)號通(tong)(tong)(tong)(tong)路在(zai)(zai)(zai)尖端(duan)(duan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)腺(xian)泡細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中被(bei)活化(hua)（圖(tu)(tu)(tu)5c）。本(ben)研究發現(xian)HES1和(he)(he)(he)(he)另一個Notch信(xin)號通(tong)(tong)(tong)(tong)路相(xiang)(xiang)關的(de)(de)(de)(de)(de)TF HEY1在(zai)(zai)(zai)導(dao)管譜系細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中高表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)，這(zhe)一發現(xian)表(biao)(biao)(biao)(biao)明Notch信(xin)號通(tong)(tong)(tong)(tong)路對于人類胰腺(xian)導(dao)管譜系細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)分化(hua)至關重要(yao)(yao)(yao)（圖(tu)(tu)(tu)5d）。為了(le)表(biao)(biao)(biao)(biao)征尖端(duan)(duan)、主(zhu)(zhu)(zhu)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)支(zhi)(zhi)持細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)之間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)信(xin)號通(tong)(tong)(tong)(tong)路關系，本(ben)研究將支(zhi)(zhi)持細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)分為6個亞型，包括成(cheng)(cheng)纖維細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、間(jian)皮(pi)(pi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、周細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、免疫細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、神(shen)經細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)內皮(pi)(pi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)通(tong)(tong)(tong)(tong)訊分析發現(xian)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)間(jian)通(tong)(tong)(tong)(tong)過Notch信(xin)號通(tong)(tong)(tong)(tong)路相(xiang)(xiang)互(hu)(hu)作用(yong)，主(zhu)(zhu)(zhu)要(yao)(yao)(yao)涉及成(cheng)(cheng)纖維細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)周細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)DLK1和(he)(he)(he)(he)JAG1基(ji)(ji)因，以及主(zhu)(zhu)(zhu)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)導(dao)管細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中的(de)(de)(de)(de)(de)NOTCH1、NOTCH2和(he)(he)(he)(he)NOTCH3基(ji)(ji)因（圖(tu)(tu)(tu)5f）。FGF信(xin)號通(tong)(tong)(tong)(tong)路對胰腺(xian)發育非常重要(yao)(yao)(yao)，研究發現(xian)FGFR2在(zai)(zai)(zai)主(zhu)(zhu)(zhu)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)導(dao)管細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中高表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)，其配體(ti)FGF7和(he)(he)(he)(he)FGF9在(zai)(zai)(zai)成(cheng)(cheng)纖維細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)間(jian)皮(pi)(pi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)(da)（圖(tu)(tu)(tu)5g）。此外(wai)，間(jian)皮(pi)(pi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)導(dao)管譜系細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)之間(jian)存(cun)在(zai)(zai)(zai)NTF4-NTRK2相(xiang)(xiang)互(hu)(hu)作用(yong)，周細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)導(dao)管譜系細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)之間(jian)存(cun)在(zai)(zai)(zai)BDNF-NTRK2相(xiang)(xiang)互(hu)(hu)作用(yong)。FGFR2和(he)(he)(he)(he)NTRK2參與MAPK級(ji)聯反應酪氨酸激(ji)酶(mei)的(de)(de)(de)(de)(de)受體(ti)。這(zhe)些結(jie)果表(biao)(biao)(biao)(biao)明，Notch和(he)(he)(he)(he)MAPK信(xin)號通(tong)(tong)(tong)(tong)路促進了(le)主(zhu)(zhu)(zhu)干(gan)(gan)和(he)(he)(he)(he)導(dao)管細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)分化(hua)。

為了構建調控細胞(bao)(bao)(bao)分化的(de)(de)基(ji)因調控網(wang)絡(GRN)，本研(yan)究整合了同(tong)一(yi)(yi)時間點的(de)(de)scRNA-seq和(he)scATAC-seq的(de)(de)數據(ju)，確(que)定了驅動腺泡(pao)和(he)導管譜系(xi)(xi)發(fa)育的(de)(de)關鍵調控因子(zi)和(he)相應的(de)(de)調控網(wang)絡，有一(yi)(yi)組(zu)(zu)TF在(zai)細胞(bao)(bao)(bao)類型特(te)異(yi)性(xing)peak中(zhong)富集(ji)，還有一(yi)(yi)組(zu)(zu)TF在(zai)這(zhe)(zhe)兩種譜系(xi)(xi)中(zhong)都(dou)普遍富集(ji)（圖5h），譜系(xi)(xi)特(te)異(yi)性(xing)轉(zhuan)錄(lu)因子(zi)的(de)(de)motif富集(ji)與(yu)其表達水平一(yi)(yi)致（圖5i），三組(zu)(zu)TF在(zai)scRNA-seq中(zhong)的(de)(de)平均表達水平與(yu)其在(zai)scATAC-seq中(zhong)的(de)(de)足(zu)(zu)跡富集(ji)一(yi)(yi)致（圖5j），對于(yu)譜系(xi)(xi)常見的(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)因子(zi)，GRN 分析表明，盡管在(zai)兩個譜系(xi)(xi)中(zhong)都(dou)觀(guan)察(cha)到了豐富的(de)(de)足(zu)(zu)跡，但(dan)這(zhe)(zhe)些轉(zhuan)錄(lu)因子(zi)在(zai)兩個譜系(xi)(xi)中(zhong)具有不同(tong)的(de)(de)靶標(biao)。在(zai)腺泡(pao)譜系(xi)(xi)中(zhong)，靶標(biao)包括各種酶和(he)蛋白(bai)酶抑制劑(ji)，如CELA2A和(he)SERPINA4；在(zai)導管譜系(xi)(xi)中(zhong)，靶標(biao)是(shi)導管細胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)標(biao)記基(ji)因COL4A1、COL4A2和(he)KRT17，以及其他導管譜系(xi)(xi)特(te)異(yi)性(xing)的(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)因子(zi)，例如 HES4 和(he) HES1（圖5k）。

為了進一(yi)步研究(jiu)(jiu)內分(fen)(fen)(fen)泌(mi)(mi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)發(fa)(fa)育的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)子機制，本研究(jiu)(jiu)對(dui)EPs和(he)(he)(he)內分(fen)(fen)(fen)泌(mi)(mi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)進行聚(ju)類(lei)分(fen)(fen)(fen)析，共鑒定出5個(ge)表(biao)達(da)(da)(da)Neurog3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)EP細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)群(qun)和(he)(he)(he)4個(ge)表(biao)達(da)(da)(da)內分(fen)(fen)(fen)泌(mi)(mi)激(ji)素基(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)內分(fen)(fen)(fen)泌(mi)(mi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)群(qun)，一(yi)些主干(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)標(biao)記物，包(bao)括(kuo)SOX9和(he)(he)(he)ID3，在EP早(zao)期(qi)(qi)(qi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中表(biao)達(da)(da)(da)，表(biao)明EP早(zao)期(qi)(qi)(qi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)在主干(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)EP細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)過渡狀態中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)作用（圖(tu)6a、6c）。接下來(lai)，本研究(jiu)(jiu)重點分(fen)(fen)(fen)析了內分(fen)(fen)(fen)泌(mi)(mi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)TF，發(fa)(fa)現ARX和(he)(he)(he)ETV1在EP α細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中活性較高，NKX6-1和(he)(he)(he)LMX1B在EP β細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中活性較高（圖(tu)6d）。內分(fen)(fen)(fen)泌(mi)(mi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)擬時(shi)軌跡(ji)分(fen)(fen)(fen)析發(fa)(fa)現，EP早(zao)期(qi)(qi)(qi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)被認為是所有內分(fen)(fen)(fen)泌(mi)(mi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)起(qi)點。epsilon細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)是EP中間細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)個(ge)分(fen)(fen)(fen)支。然后，EP晚期(qi)(qi)(qi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)首先(xian)分(fen)(fen)(fen)化為EP alpha細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，然后分(fen)(fen)(fen)化為delta 和(he)(he)(he) EP beta細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)。最后，EP alpha細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)EP beta細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)產生alpha和(he)(he)(he)beta細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)（圖(tu)6e、6f）。接下來(lai)將EP早(zao)期(qi)(qi)(qi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、EP中間細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)EP晚期(qi)(qi)(qi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)按照擬時(shi)間變(bian)化的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)聚(ju)成4個(ge)cluster，如Cluster-1基(ji)因(yin)(yin)(yin)，包(bao)括(kuo)TEAD2、SOX4和(he)(he)(he)NEUROG3，在EP早(zao)期(qi)(qi)(qi)和(he)(he)(he)EP中期(qi)(qi)(qi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中表(biao)達(da)(da)(da)上調，對(dui)應(ying)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)功能富(fu)集分(fen)(fen)(fen)析發(fa)(fa)現該基(ji)因(yin)(yin)(yin)參與了上皮管的(de)(de)(de)(de)(de)(de)形態發(fa)(fa)生和(he)(he)(he)神經(jing)元分(fen)(fen)(fen)化（圖(tu)6g、6h）。綜(zong)上，本研究(jiu)(jiu)描繪(hui)了人類(lei)胰腺胚胎發(fa)(fa)育過程中EP和(he)(he)(he)內分(fen)(fen)(fen)泌(mi)(mi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)化軌跡(ji)（圖(tu)6i）。

為了(le)(le)確定人(ren)(ren)類(lei)和(he)小鼠胚胎(tai)(tai)發育(yu)過程中(zhong)主(zhu)要(yao)胰(yi)腺(xian)上皮細(xi)胞(bao)類(lei)型(xing)的(de)(de)分子特(te)征，本研究將胰(yi)腺(xian)數(shu)據集與(yu)兩(liang)個(ge)(ge)已發表(biao)的(de)(de)E9.5至E17.5小鼠胚胎(tai)(tai)胰(yi)腺(xian)數(shu)據集進(jin)行了(le)(le)比較（其中(zhong)E9.5至E17.5階段對應(ying)于人(ren)(ren)類(lei)PCW 4至11），分別整合了(le)(le)非內分泌和(he)內分泌細(xi)胞(bao)數(shu)據集（圖(tu)7a、7b），發現人(ren)(ren)類(lei)背(bei)側(ce)MP細(xi)胞(bao)與(yu)小鼠的(de)(de)早期MP細(xi)胞(bao)表(biao)達(da)(da)模式(shi)更為相似，此外，一(yi)些(xie)TF，包(bao)括GATA5、RFX6、NKX6-2和(he)NEUROG3，僅(jin)在小鼠MP細(xi)胞(bao)中(zhong)表(biao)達(da)(da)，而(er)其他TF，包(bao)括NR2F1、TBX3和(he)ID4，僅(jin)在人(ren)(ren)背(bei)側(ce)或腹(fu)側(ce)MP細(xi)胞(bao)中(zhong)表(biao)達(da)(da)（圖(tu)7d）。結果表(biao)明，盡管人(ren)(ren)類(lei)和(he)小鼠的(de)(de)發育(yu)軌跡(ji)是保(bao)守的(de)(de)，但兩(liang)個(ge)(ge)物(wu)種之間揭(jie)示了(le)(le)一(yi)些(xie)明顯的(de)(de)特(te)征，如(ru)不同的(de)(de)基因表(biao)達(da)(da)模式(shi)。

本(ben)研(yan)究(jiu)分(fen)析(xi)了(le)(le)(le)胰(yi)(yi)腺(xian)(xian)(xian)(xian)上(shang)皮細(xi)胞(bao)(bao)的(de)主(zhu)要細(xi)胞(bao)(bao)類(lei)(lei)型，包括背側和(he)腹側MP細(xi)胞(bao)(bao)，并(bing)揭(jie)示了(le)(le)(le)它們的(de)分(fen)子異質性和(he)發(fa)育(yu)(yu)軌(gui)跡。分(fen)析(xi)了(le)(le)(le)腺(xian)(xian)(xian)(xian)泡和(he)導管譜(pu)系細(xi)胞(bao)(bao)的(de)TFs、調控網絡和(he)信號通路，揭(jie)示了(le)(le)(le)內分(fen)泌的(de)調控網絡以(yi)及(ji)EP和(he)內分(fen)泌細(xi)胞(bao)(bao)的(de)轉(zhuan)(zhuan)錄動力(li)學。研(yan)究(jiu)進一步比較了(le)(le)(le)人類(lei)(lei)和(he)小(xiao)鼠(shu)之間的(de)發(fa)育(yu)(yu)軌(gui)跡，并(bing)確定了(le)(le)(le)每個(ge)(ge)物種的(de)幾(ji)個(ge)(ge)不同特征。綜上(shang)所述，研(yan)究(jiu)數(shu)據描繪了(le)(le)(le)單細(xi)胞(bao)(bao)水平妊娠早(zao)(zao)期（PCW 4-11）胰(yi)(yi)腺(xian)(xian)(xian)(xian)發(fa)生的(de)發(fa)育(yu)(yu)軌(gui)跡。本(ben)研(yan)究(jiu)為人類(lei)(lei)胰(yi)(yi)腺(xian)(xian)(xian)(xian)早(zao)(zao)期發(fa)育(yu)(yu)的(de)轉(zhuan)(zhuan)錄動力(li)學提(ti)供了(le)(le)(le)寶貴的(de)資源，也為體外生成胰(yi)(yi)腺(xian)(xian)(xian)(xian)細(xi)胞(bao)(bao)提(ti)供了(le)(le)(le)藍圖。