人(ren)(ren)類的衰(shuai)老(lao)(lao)是一個不可避免的、漸進的、全身(shen)性的過(guo)程，其中免疫系(xi)統的惡(e)化是導(dao)致機(ji)體走(zou)向衰(shuai)老(lao)(lao)的關鍵(jian)因(yin)素，免疫系(xi)統隨年齡的增(zeng)長(chang)而(er)逐步退化的分(fen)子證據以及導(dao)致一些老(lao)(lao)年人(ren)(ren)保持高免疫性能而(er)其他許多人(ren)(ren)脆弱的機(ji)制，仍(reng)在進一步探索中。

老年衰弱綜(zong)合(he)征(zheng)（Frailty）是(shi)老年人生理儲備(bei)下降導(dao)致機(ji)(ji)體易損性(xing)增加(jia)、抗(kang)應激能力減退的非特異(yi)性(xing)狀態，是(shi)個(ge)體介于身體機(ji)(ji)能正(zheng)常到逐步喪失進而死亡的過渡狀態。老年衰弱綜(zong)合(he)征(zheng)的顯著特征(zheng)之一是(shi)機(ji)(ji)體多(duo)系(xi)統的失調。免疫(yi)系(xi)統惡化是(shi)衰弱的關鍵(jian)標志，在衰弱的病(bing)因和發病(bing)機(ji)(ji)制中(zhong)起(qi)重要作用(yong)。

臨床(chuang)問題(ti)：老年衰弱綜合征(zheng)的免(mian)疫(yi)表型(xing)及其潛在的細胞和分(fen)子(zi)過(guo)程是什(shen)么(me)？

前人研(yan)究：bulk水平研(yan)究PBMC和其它免(mian)疫細胞中(zhong)與衰老(lao)相關基因得表達變化

本研究意義：深入理解了老(lao)年衰(shuai)弱綜合征(zheng)中免疫(yi)衰(shuai)老(lao)機制

取樣(yang)策略：取新生兒臍帶血（n=3）、青年組(zu)PBMCs（n=3）、健(jian)康老年組(zu)PBMCs（n=6）和體弱(ruo)老年組(zu)PBMCs（n=5）進行scRNA-seq+scTCR-seq

結果一：不(bu)同年齡組的免疫細(xi)胞圖譜

本(ben)研究將(jiang)獲(huo)得(de)的(de)114,467個(ge)高質量(liang)單細(xi)胞聚(ju)成(cheng)17個(ge)cluster，根據經(jing)典marker基因(yin)的(de)表達對cluster進(jin)行注釋(shi)（圖1b、c），發現臍帶血樣本(ben)包(bao)含非常少(shao)的(de)記(ji)憶(yi)T細(xi)胞（cluster2和(he)cluster3）和(he)“other T cells”（cluster6和(he)cluster9），這可能(neng)意味著cluster6和(he)cluster9的(de)細(xi)胞處于更(geng)活躍(yue)的(de)狀(zhuang)態(tai)或具有成(cheng)人(ren)特有的(de)T細(xi)胞特性。此外，“other T cells”的(de)比例隨著樣本(ben)年齡的(de)增加而逐漸上升（圖1d、e）。

圖1 同(tong)年(nian)齡組的免疫細胞圖譜

結果二：衰老過程中T細(xi)胞(bao)亞型(xing)的(de)動(dong)態變化

本研(yan)究提取cluster1/2/3/6/9重新聚類分群，定(ding)義(yi)了6個(ge)亞群，如圖2f，隨著(zhu)年齡的(de)(de)增長，T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)組(zu)成向功能(neng)更(geng)完善(shan)的(de)(de)記憶性T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉(zhuan)移；臍(qi)帶(dai)血(xue)組(zu)T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)以Na?ve T為主，Na?ve T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)比例隨著(zhu)年齡的(de)(de)增長而呈(cheng)現出(chu)減少的(de)(de)趨勢，從青年組(zu)過渡至(zhi)老(lao)年組(zu)時，Na?ve T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)數量更(geng)是急(ji)劇下降；3組(zu)成人組(zu)中，體弱老(lao)年組(zu)CD4+TCM細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)較多，健康(kang)老(lao)年組(zu)CD8+TCM和Treg細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)較多。這可能(neng)意味著(zhu)CD8+和CD4+T CM細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)之間的(de)(de)平衡(heng)在(zai)維持老(lao)年人免疫系(xi)統的(de)(de)活力中起著(zhu)重要作用（圖2i、h）。在(zai)老(lao)年組(zu)中發現了高(gao)表達長鏈(lian)非編碼RNA NEAT1和MALAT1的(de)(de)T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，這意味著(zhu)NEAT1和MALAT1可能(neng)是淋巴細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)老(lao)化(hua)的(de)(de)標志（圖2g）。

圖2 衰(shuai)老過(guo)程中T細胞亞型(xing)的動態變化(hua)

結(jie)果(guo)三(san)：剖(pou)析T細胞轉錄組特征與TCR動態趨(qu)勢

研究發現(xian)Na?ve T細(xi)胞(bao)發生的克(ke)隆(long)(long)(long)型擴增(zeng)頻(pin)(pin)率較低，相反，記憶T細(xi)胞(bao)，特別是來自老(lao)弱群體(ti)的CD4+TCM細(xi)胞(bao)，具有較高的克(ke)隆(long)(long)(long)型擴增(zeng)頻(pin)(pin)率（圖3a）。從新生組到(dao)體(ti)弱老(lao)年(nian)組，TCR克(ke)隆(long)(long)(long)多樣性逐漸降低（圖3b）。共(gong)享克(ke)隆(long)(long)(long)型出現(xian)在 CD8+ TCM, CD8+ TEM, exhausted T，CD4+ TCM 和 Treg cells中，naiveT細(xi)胞(bao)共(gong)享克(ke)隆(long)(long)(long)型較少（圖3c：+代表對應細(xi)胞(bao)亞型間(jian)有共(gong)享克(ke)隆(long)(long)(long)型）

共(gong)享的(de) TCR 克隆型主要在成年(nian)供(gong)體中觀察(cha)到，特(te)(te)(te)別是(shi)在old、Frail組(zu)中（圖(tu)(tu)3d）。將(jiang)共(gong)享TCR序(xu)(xu)列與(yu)以前報(bao)道(dao)過的(de)抗原(yuan)特(te)(te)(te)異性(xing)(xing)TCR序(xu)(xu)列進(jin)行比對，單獨Alpha或(huo)Beta鏈匹配(pei)上的(de)抗原(yuan)特(te)(te)(te)異性(xing)(xing)TCR序(xu)(xu)列遠高于配(pei)對的(de)，這很可能是(shi)因為(wei)以前發現(xian)的(de)抗原(yuan)特(te)(te)(te)異性(xing)(xing)TCR大多是(shi)不配(pei)對的(de)（圖(tu)(tu)3e）共(gong)享TCR匹配(pei)到的(de)是(shi)CMV/EBV/IAV等抗原(yuan)（圖(tu)(tu)3f）。ELISA實驗(yan)（驗(yan)證試驗(yan)）發現(xian)CMV抗原(yuan)特(te)(te)(te)異性(xing)(xing)TCRs只在old、Frail組(zu)中被鑒(jian)定出來（圖(tu)(tu)3g），部分具有CMV抗原(yuan)特(te)(te)(te)異性(xing)(xing)TCRs的(de)供(gong)者對CMV抗體呈陽性(xing)(xing)（圖(tu)(tu)3h）

圖3 剖析T細胞轉錄組特征與TCR動態趨勢

結果(guo)四：免疫細胞(bao)異質(zhi)性(xing)以及(ji)共同(tong)的衰老特(te)征

隨著年(nian)齡的增(zeng)(zeng)長，16種細(xi)(xi)胞(bao)(bao)類型中(zhong)的大多數(shu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)亞群表現出更加(jia)多樣(yang)化的轉錄特征(zheng)（圖4a），推測血液中(zhong)免疫(yi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)存在異質(zhi)性的原因(yin)可能與隨著年(nian)齡增(zeng)(zeng)長不(bu)斷暴(bao)露的細(xi)(xi)胞(bao)(bao)外(wai)抗(kang)原增(zeng)(zeng)加(jia)有(you)關。通過(guo)組間差異分(fen)析(xi)找(zhao)組特異性基(ji)因(yin)，再看(kan)組特異性基(ji)因(yin)在細(xi)(xi)胞(bao)(bao)亞群的表達(da)情況，有(you)無(wu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)類型偏(pian)好，發現年(nian)輕(qing)組幾乎無(wu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)類型偏(pian)好（圖4c）。功能富(fu)(fu)集(ji)分(fen)析(xi)發現例如臍帶血特異性基(ji)因(yin)(如SOX4、FCER1G和(he)STMN1)集(ji)中(zhong)在T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)亞型中(zhong)，這些基(ji)因(yin)在淋巴細(xi)(xi)胞(bao)(bao)激活和(he)分(fen)化功能中(zhong)富(fu)(fu)集(ji)（圖4d、e）。最后通過(guo)Qpcr驗(yan)證特異性基(ji)因(yin)表達(da)（圖4f）。

圖4 免疫細胞異質性以及共同的衰老特征

結果五：特定(ding)年齡組(zu)和特定(ding)細胞類(lei)型的轉錄(lu)調(diao)控分析

分(fen)析發現大(da)多(duo)展示的(de)是(shi)不(bu)同(tong)分(fen)組(zu)中某(mou)一(yi)種細(xi)胞(bao)類型(xing)特有的(de)regulon（圖(tu)5a），調控網絡圖(tu)展示大(da)多(duo)數靶基(ji)(ji)因(yin)(yin)都(dou)被一(yi)個轉(zhuan)錄因(yin)(yin)子(zi)專一(yi)靶向(xiang)(xiang)，表明(ming)所識別的(de)regulon具有較(jiao)高的(de)特異性（圖(tu)5b）。通(tong)過比較(jiao)靶基(ji)(ji)因(yin)(yin)在不(bu)同(tong)分(fen)組(zu)、不(bu)同(tong)細(xi)胞(bao)類型(xing)的(de)表達水平，TF可能起到正向(xiang)(xiang)或負(fu)向(xiang)(xiang)調節作(zuo)用(yong)(yong)。例(li)如， Krüppel-like family 的(de)KLF2（源于新生兒臍帶血(xue)組(zu)和體弱(ruo)老年(nian)組(zu)的(de)NK細(xi)胞(bao)）和KLF6（源于健康老年(nian)組(zu)的(de)NK細(xi)胞(bao)）對靶基(ji)(ji)因(yin)(yin)是(shi)正向(xiang)(xiang)調節作(zuo)用(yong)(yong)，而KLF3 （源于青年(nian)組(zu)的(de)T細(xi)胞(bao)）對靶基(ji)(ji)因(yin)(yin)是(shi)負(fu)向(xiang)(xiang)調節作(zuo)用(yong)(yong)，與先(xian)前已知的(de)Krüppel-like factors的(de)功能是(shi)一(yi)致的(de)（圖(tu)5d）。

圖5 特定年齡組和特定細胞類型的轉錄調控分析

結果六(liu)：不(bu)同細(xi)胞類型的(de)免疫衰老(lao)軌跡（以(yi)naiveT細(xi)胞為例）

擬時軌跡分(fen)(fen)析(xi)描繪了來自不同年齡組的(de)naiveT細胞沿(yan)著假時間尺度(du)的(de)遞增，來自臍(qi)帶(dai)(dai)血(xue)(xue)的(de)細胞主要(yao)聚集(ji)在早期末(mo)端(duan)，而來自三個(ge)成年組的(de)細胞位于2個(ge)分(fen)(fen)支上（圖6ab），SOX4基(ji)因(yin)(yin)（與(yu)T細胞分(fen)(fen)化與(yu)遷移相關(guan)）在主要(yao)來自臍(qi)帶(dai)(dai)血(xue)(xue)的(de)naiveT細胞中高(gao)表達（圖6d），可定為生(sheng)物學起點。部分(fen)(fen)核糖體(ti)蛋白(bai)編(bian)碼(ma)基(ji)因(yin)(yin)表現出選擇(ze)性表達特征(zheng)，RPS24、RPS29、RPS12和(he)RPS14在早、中晚期互斥表達（圖6c），對Late1和(he)Late2（圖6e）差異(yi)基(ji)因(yin)(yin)分(fen)(fen)析(xi)發現old組上調差異(yi)基(ji)因(yin)(yin)涉(she)及Toll-like receptor and MAPK signaling pathways（DUSP1, FOS, JUN和(he)NFKB2），Frail組上調差異(yi)基(ji)因(yin)(yin)涉(she)及病毒反應(ying)和(he)細胞凋(diao)亡（DDIT3和(he)MX1），推測來自old組的(de)naive T細胞在功(gong)能上比來自Frail組的(de)naive T細胞更活躍。

圖6  naiveT細胞的免疫衰老軌跡分析

結(jie)果七：體(ti)弱老(lao)年組特異性的單(dan)核細胞亞群（Frailty-specific monocytes）分析

提取cluster4/10/12重新聚(ju)類分群，發現(xian)一群Frailty-specific monocytes（圖(tu)7a），lncRNAs NEAT1 和(he)(he) MALAT1，與癌癥(zheng)和(he)(he)全基(ji)因(yin)組基(ji)因(yin)調控功(gong)(gong)能(neng)有(you)(you)關(guan)而(er)廣為(wei)人(ren)知(zhi)，而(er)Frailty-specific monocytes高(gao)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)該基(ji)因(yin)（圖(tu)7b），Frailty-specific monocytes 和(he)(he)其它(ta)類型單核(he)(he)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)差異(yi)分析和(he)(he)功(gong)(gong)能(neng)富集(ji)分析發現(xian)上調基(ji)因(yin)富集(ji)到與炎癥(zheng)反應和(he)(he)衰(shuai)(shuai)老有(you)(you)關(guan)的(de)(de)(de)功(gong)(gong)能(neng)，下調基(ji)因(yin)富集(ji)到對(dui)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)吐、髓系細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)活化和(he)(he)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)凋亡具(ju)有(you)(you)重要(yao)(yao)作用的(de)(de)(de)功(gong)(gong)能(neng)（圖(tu)7d）。前人(ren)報道NEAT1 是髓系細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)（包(bao)括單核(he)(he)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)巨噬(shi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)）中的(de)(de)(de)炎癥(zheng)激活劑，通過(guo)(guo)NEAT1基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)過(guo)(guo)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)來探索NEAT1與細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)衰(shuai)(shuai)老的(de)(de)(de)關(guan)系，首先確定了NEAT1、IL1B 和(he)(he) IL6 以及(ji)一系列細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)衰(shuai)(shuai)老標記基(ji)因(yin)CDKN1A、CDKN2A 和(he)(he) SIRT1的(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)（圖(tu)7e），接(jie)下來，NEAT1 的(de)(de)(de)過(guo)(guo)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)顯著(zhu)增(zeng)加(jia)了炎癥(zheng)反應（IL1B、IL6 和(he)(he) IL8）和(he)(he)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)衰(shuai)(shuai)老（CDKN2A、CDKN1A、SIRT1 和(he)(he) β-半乳糖苷酶）標志物(wu)的(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)（圖(tu)7f-i），故可(ke)推測 NEAT1基(ji)因(yin)促進衰(shuai)(shuai)老單核(he)(he)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)炎癥(zheng)反應，進而(er)導(dao)致(zhi)虛弱。MAFB 和(he)(he) RELB 在脆弱的(de)(de)(de)單核(he)(he)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中均表(biao)(biao)(biao)(biao)現(xian)出相對(dui)較高(gao)的(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)達(da)水平，而(er)脆弱的(de)(de)(de)單核(he)(he)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)具(ju)有(you)(you)適(shi)度高(gao)的(de)(de)(de) MAFB 和(he)(he) RELB 調節子活性，這表(biao)(biao)(biao)(biao)明 RELB 作為(wei)潛在的(de)(de)(de)主要(yao)(yao)調節因(yin)子導(dao)致(zhi)脆弱的(de)(de)(de)單核(he)(he)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)性質受損(sun)（圖(tu)7j、k）。

圖7  體弱老年組特異性的單核細胞亞群分析

本(ben)研究構建了(le)從新(xin)生兒(er)到(dao)衰弱的(de)人類免疫(yi)細(xi)(xi)胞(bao)單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)水平(ping)的(de)轉錄組譜圖和TCR克隆(long)型圖譜。為發(fa)現免疫(yi)衰老(lao)和衰弱的(de)新(xin)細(xi)(xi)胞(bao)類型、特(te)異性細(xi)(xi)胞(bao)標記和全球基因組資源提供了(le)見解，有助于我們解釋衰弱的(de)發(fa)病機(ji)制(zhi)。