2023-11-16
前言
在之(zhi)前的(de)軟文中(zhong)，我們(men)(men)已經對熒(ying)光(guang)定(ding)量(liang)PCR的(de)原理(li)、分類、流程、方法和實驗結(jie)果給(gei)小伙(huo)伴(ban)們(men)(men)做了(le)詳(xiang)細的(de)介紹(shao)，但是熒(ying)光(guang)定(ding)量(liang)PCR技(ji)術具體(ti)有(you)哪些應(ying)用呢？以及(ji)熒(ying)光(guang)定(ding)量(liang)PCR和高通(tong)量(liang)測序有(you)著怎樣密(mi)不可(ke)分的(de)關聯呢？今天(tian)我們(men)(men)將(jiang)給(gei)小伙(huo)伴(ban)們(men)(men)一一揭曉！ 微生物樣本高通量測序——絕對定量：從相對豐度到絕對豐度 微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)與人類的生(sheng)(sheng)活密不可分(fen)，在大自然的各個角(jiao)落，都可以看到微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)的身影。微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)樣(yang)本也是多(duo)種多(duo)樣(yang)，包括環(huan)境微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)組：土壤、水體、污泥、空氣(qi)等(deng)(deng)；腸道(dao)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)組：胃黏膜(mo)、唾(tuo)液(ye)(ye)、肺(fei)部(bu)灌洗液(ye)(ye)、分(fen)泌物(wu)(wu)(wu)、糞便，小鼠腸道(dao)，反芻動(dong)物(wu)(wu)(wu)瘤(liu)胃等(deng)(deng)；工業微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)組：傳(chuan)統發(fa)酵液(ye)(ye)、生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)冶金或活性物(wu)(wu)(wu)質等(deng)(deng)。 對(dui)(dui)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物樣(yang)本進行高(gao)通(tong)量測序(xu)與(yu)(yu)生(sheng)(sheng)物信息學分(fen)析，可以了解樣(yang)本中(zhong)的(de)各類微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物組成(cheng)情況，掌握微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物的(de)多樣(yang)性分(fen)布(bu)，獲(huo)取(qu)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物樣(yang)本中(zhong)氮循(xun)(xun)環(huan)、碳循(xun)(xun)環(huan)、磷(lin)循(xun)(xun)環(huan)、硫(liu)循(xun)(xun)環(huan)等(deng)各類功能基(ji)因的(de)組成(cheng)與(yu)(yu)分(fen)布(bu)情況。解析樣(yang)本中(zhong)的(de)物種組成(cheng)和相(xiang)對(dui)(dui)豐度(du)信息，對(dui)(dui)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)態研究具有重(zhong)要的(de)促進作用。 然而我們需要注意一(yi)點，那就是(shi)相(xiang)(xiang)對(dui)(dui)豐度(du)(du)(du)(du)并不能(neng)(neng)反(fan)映樣(yang)(yang)(yang)本(ben)中每(mei)種微(wei)(wei)(wei)生物(wu)(wu)的(de)(de)真(zhen)實數量(liang)和組間樣(yang)(yang)(yang)本(ben)的(de)(de)真(zhen)實差(cha)(cha)(cha)異。由于技術限制,高通(tong)量(liang)測序(xu)結(jie)果只能(neng)(neng)反(fan)映樣(yang)(yang)(yang)本(ben)中微(wei)(wei)(wei)生物(wu)(wu)及(ji)各類(lei)基因的(de)(de)分類(lei)及(ji)其相(xiang)(xiang)對(dui)(dui)豐度(du)(du)(du)(du),不同(tong)分類(lei)水平微(wei)(wei)(wei)生物(wu)(wu)和基因的(de)(de)絕對(dui)(dui)豐度(du)(du)(du)(du)卻不能(neng)(neng)獲得。當樣(yang)(yang)(yang)本(ben)間微(wei)(wei)(wei)生物(wu)(wu)總量(liang)變(bian)化較大時,以相(xiang)(xiang)對(dui)(dui)豐度(du)(du)(du)(du)表(biao)征(zheng)不同(tong)樣(yang)(yang)(yang)本(ben)間的(de)(de)微(wei)(wei)(wei)生物(wu)(wu)數量(liang)及(ji)基因含(han)量(liang)的(de)(de)差(cha)(cha)(cha)異,可能(neng)(neng)會帶來(lai)誤差(cha)(cha)(cha),甚(shen)至是(shi)相(xiang)(xiang)反(fan)的(de)(de)結(jie)論。 相(xiang)比于相(xiang)對(dui)豐度(du)，絕(jue)(jue)對(dui)定量(liang)(liang)分析能反映樣本中每種微生(sheng)(sheng)物甚至每類(lei)基因的(de)(de)真(zhen)實(shi)數量(liang)(liang)和組(zu)間樣本的(de)(de)真(zhen)實(shi)差異，因此絕(jue)(jue)對(dui)定量(liang)(liang)分析更能反映樣本微生(sheng)(sheng)物的(de)(de)真(zhen)實(shi)變化，是微生(sheng)(sheng)態研究(jiu)中不可或缺的(de)(de)環節(jie)。而熒(ying)光(guang)定量(liang)(liang)PCR是定量(liang)(liang)物種絕(jue)(jue)對(dui)豐度(du)的(de)(de)金標準！ 例(li)如：想知道取(qu)自不(bu)同地區的(de)土(tu)壤樣本(ben)中細菌、真菌、甲烷氧化菌的(de)總含量差異(yi)，使用高通量測序(xu)技術(shu)便(bian)無法獲取(qu)其(qi)真實數量與(yu)組(zu)間樣本(ben)差異(yi)，這時候(hou)就(jiu)需要使用熒光定量PCR——絕對定量技術(shu)了！ 通過使用細菌16S、真(zhen)菌ITS、甲烷氧化(hua)(hua)菌pmoA的(de)引物對樣(yang)(yang)本總(zong)DNA進行擴(kuo)增(zeng)，在(zai)PCR反應體系中(zhong)加(jia)入熒光化(hua)(hua)學物質，得到(dao)不(bu)同樣(yang)(yang)本中(zhong)對應PCR產(chan)物熒光信號(hao)達到(dao)閾值(zhi)時所需要的(de)循環數（Ct值(zhi)）。利用已知拷貝數的(de)標準(zhun)品(pin)作出(chu)標準(zhun)曲線(xian)，通過帶入土壤樣(yang)(yang)品(pin)中(zhong)的(de)16S、ITS、pmoA擴(kuo)增(zeng)產(chan)物的(de)Ct值(zhi)，即(ji)可根據(ju)標準(zhun)曲線(xian)計(ji)算出(chu)土壤樣(yang)(yang)品(pin)中(zhong)16S、ITS、pmoA的(de)基因(yin)拷貝數。 不同(tong)土壤樣品中16S、ITS、pmoA的基因(yin)(yin)拷貝數，即為樣品中對應(ying)基因(yin)(yin)的總含量，代(dai)表著細菌(jun)(jun)(jun)、真菌(jun)(jun)(jun)、甲烷(wan)氧化(hua)菌(jun)(jun)(jun)的絕對豐度，體現(xian)土壤樣本中細菌(jun)(jun)(jun)、真菌(jun)(jun)(jun)、甲烷(wan)氧化(hua)菌(jun)(jun)(jun)的總含量水平與差異。 轉錄組測序——相對定量：對大規模差異表達基因篩選的實驗驗證 轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄(lu)組測序(Transcriptome sequencing)是通過高(gao)通量測序技術快(kuai)速全面地獲得某一物種特定細胞或組織在某一狀態下(xia)的(de)幾乎所有(you)的(de)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄(lu)本及基(ji)因序列并進行測序分(fen)析。通過轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄(lu)組測序，可(ke)以幫助我們了解各種比(bi)較條(tiao)件下(xia)所有(you)基(ji)因的(de)表(biao)達差異，而轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄(lu)組的(de)主要目的(de)之(zhi)一便是尋(xun)找(zhao)基(ji)因表(biao)達的(de)差異。 由(you)于技(ji)術限制，轉(zhuan)錄組測(ce)序往往用于差(cha)異表(biao)達基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)大(da)規模篩選，反(fan)應樣本(ben)整體的(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)表(biao)達變化(hua)趨勢，但不能保證每(mei)一(yi)個基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)變化(hua)趨勢都與實際情況保持一(yi)致。因(yin)(yin)此，對轉(zhuan)錄組測(ce)序分(fen)(fen)析篩選出的(de)(de)差(cha)異表(biao)達基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)實際表(biao)達差(cha)異進(jin)行實驗驗證就(jiu)顯得十分(fen)(fen)必要。 目前來說，熒光定(ding)量(liang)PCR技術是(shi)驗(yan)證基因表達(da)差(cha)異的金標準。Q-PCR驗(yan)證是(shi)轉錄組(zu)測(ce)(ce)序分析下游必不可少的補(bu)充驗(yan)證實(shi)驗(yan)，是(shi)發文章所(suo)必須的。一般根據轉錄組(zu)測(ce)(ce)序的差(cha)異表達(da)基因分析結果，驗(yan)證15-20個差(cha)異基因比較(jiao)合(he)適。 熒光(guang)(guang)(guang)定(ding)量(liang)PCR技(ji)術通過在PCR反(fan)應(ying)體系中(zhong)引入一種熒光(guang)(guang)(guang)化(hua)學(xue)物(wu)質，對(dui)PCR擴(kuo)增反(fan)應(ying)中(zhong)每一個循(xun)環產物(wu)的熒光(guang)(guang)(guang)信號(hao)進行實時檢(jian)測(ce)，得(de)到(dao)一條熒光(guang)(guang)(guang)擴(kuo)增曲線圖，以(yi)此對(dui)初始模板(ban)進行定(ding)量(liang)分(fen)析。相對(dui)定(ding)量(liang)技(ji)術往(wang)往(wang)用于轉錄組測(ce)序下游的基因差異表達驗證。 相對定量(liang)(liang)是以待測樣(yang)本(ben)的(de)RNA反轉錄(lu)的(de)cDNA為模版(ban)進行(xing)PCR擴增，通過設計(ji)靶(ba)(ba)序(xu)(xu)列(lie)的(de)特異引(yin)物擴增靶(ba)(ba)序(xu)(xu)列(lie)的(de)特異序(xu)(xu)列(lie)，根據靶(ba)(ba)序(xu)(xu)列(lie)相對于對照樣(yang)本(ben)的(de)量(liang)(liang)的(de)變化(hua)(hua)，比(bi)較兩個或(huo)多個不(bu)同處理的(de)樣(yang)本(ben)中(zhong)的(de)基(ji)因表達水(shui)平的(de)高低變化(hua)(hua)，得到的(de)結果是表達量(liang)(liang)差異的(de)比(bi)率(lv)。在(zai)(zai)此過程中(zhong)要選取(qu)一定的(de)內參(can)基(ji)因，以除(chu)去(qu)不(bu)同標本(ben)在(zai)(zai)RNA產量(liang)(liang)、質量(liang)(liang)以及反轉錄(lu)效率(lv)上可能存在(zai)(zai)的(de)差別，進行(xing)校正和標準(zhun)化(hua)(hua)。 轉(zhuan)錄組(zu)測(ce)序(xu)與熒(ying)光定(ding)量PCR本身就是(shi)兩(liang)(liang)種(zhong)不同的實驗平臺，兩(liang)(liang)者不能一(yi)(yi)一(yi)(yi)對應。對于轉(zhuan)錄組(zu)測(ce)序(xu)分(fen)析的差異(yi)表達基因，一(yi)(yi)般是(shi)挑選大(da)量的基因驗證(zheng)，兩(liang)(liang)者的結果(guo)從(cong)統計(ji)學(xue)上來說存在(zai)較(jiao)高的相(xiang)關性（r2>0.8），視為驗證(zheng)成功。在(zai)文章中(zhong)展示(shi)的熒(ying)光定(ding)量PCR結果(guo)往往是(shi)和轉(zhuan)錄組(zu)測(ce)序(xu)分(fen)析結果(guo)一(yi)(yi)致的差異(yi)表達基因，對于其他(ta)驗證(zheng)結果(guo)不好的、與預期(qi)結果(guo)不符(fu)或(huo)者不能闡述清楚與預期(qi)結果(guo)不符(fu)原(yuan)因的基因則(ze)選擇不在(zai)文章中(zhong)呈(cheng)現了。qPCR驗證(zheng)測(ce)序(xu)結果(guo)的吻合率(lv)通常為60~70%。 總 結 不(bu)論是對(dui)微(wei)生物樣本高通量(liang)測序分析結(jie)果的(de)數據擴充，將(jiang)微(wei)生物多樣性(xing)、宏基因(yin)組分析的(de)相對(dui)豐度數據進(jin)一步補(bu)充絕對(dui)豐度數據，還是對(dui)轉(zhuan)錄組測序分析結(jie)果差(cha)異表達基因(yin)的(de)驗(yan)證，都離(li)不(bu)開熒光(guang)定量(liang)PCR技術的(de)下游補(bu)充與完善。正在(zai)做或(huo)者打(da)算(suan)做微(wei)生物、轉(zhuan)錄組高通量(liang)測序的(de)小伙伴們，千萬(wan)不(bu)要忘記下游的(de)熒光(guang)定量(liang)PCR實驗(yan)哦！
