2023-11-22
前言
N6-methyladenosine(m6A)是真核生物中mRNA最普遍且豐富的內源性修飾，主要參與調控premRNA到成熟mRNA的過程，并且在細胞分化和重編程、應激反應、胚胎發生和腫瘤發生的過程中發揮重要作用。自m6A首次發表以來，已經開發了很多技術，例如基于抗體的PA-m6A-seq、miCLIP、m6A-CLIP以及不基于抗體的DART-seq、MAZTER-seq等技術。m6A通常需要大量的輸入材料。迄今為止報道的最低起始量10ng的DART-seq，然而，DART-seq需要細胞中APOBEC1-YTH表達，以誘導m6A附近的C到U的脫氨作用，從而限制了其在培養細胞中的應用。盡管取得了這些進步，但仍需要高靈敏度且適用低RNA/細胞起始量的胞內m6A全轉錄組鑒定方法。
2023年6月，挪威奧斯陸大學的Arne Klungland課題組和密西根大學Kin Fai Au課題組聯合在Nature Biotechnology發表研究論文：Single-cell m6A mapping in vivo using picoMeRIP-seq，開發了一種基于抗體的低RNA/細胞起始量的m6A鑒定技術picoMeRIP-seq，該方法可以用于全轉錄組水平鑒定100pg PolyA RNA、單個斑馬魚、單個小鼠卵子和早期胚胎以及胚胎干細胞的m6A圖譜鑒定。該方法蛀牙對一些關鍵步驟進行優化：(1)細胞裂解方法以及采用一步管方法去除gDNA和rRNA；(2)通過超聲處理進行RNA片段化；(3)選擇具有較好特異性的商業m6A抗體；(4)抗體結合后RNA洗滌條件優化：提高表面活性劑和鹽濃度去除非特異結合材料。如圖1(a)所示。首先從RNA投入量、重復性、關鍵分析參數、特異性水平和背景對picoMeRIP-seq的重復及定量性能、可靠性等進行評估。如圖1(c、d、e)所示。其次將picoMeRIP-seq應用于單個斑馬魚受精卵進行原理驗證單細胞m6A分析的可行性。如圖1(f、g)所示。根據評估結果支持了picoMeRIP-seq對m6A鑒定具有高特異性和實用性。最后為了進一步證明該方法的多功能性，將picoMeRIP-seq應用于熒光激活細胞分選的mES細胞，實驗結果具有良好的重復性和非常好的m6A峰，但沒有獲得足夠的文庫進行測序，后續可以嘗試進一步優化。 圖1 最終對picoMeRIP-seq進行基準測試，將該方法應用到單個小鼠受精卵和著床前胚胎(雙細胞，八細胞和囊胚階段的單小鼠生發囊泡階段卵母細胞)，中期I期階段卵母細胞和單個胚胎的全程的轉錄組m6A修飾圖譜的檢測。PCA分析顯示受精卵到胚胎的各個階段的m6A修飾可以將各個發育時期很好的區分。根據m6A修飾的基序分析，發現m6A主要定位在翻譯終止子附近，并且顯著富集經典的m6A序列RRACH(R=G/A，H=A/C/U)，這與作者之前的研究結果相一致，表明m6A標記的MERVL轉錄本在ZGA中的潛在調節作用。如圖2所示。 圖2 綜上所述，目前已經開發并基準化一種用于低RNA/細胞起始量的胞內m6A修飾圖譜鑒定的技術-picoMeRIP-seq，該技術的實驗靈敏度允許單卵母細胞和單胚胎細胞研究，從而開啟人類卵母細胞和植入前胚胎生育力與發育缺陷的相關性研究的新時代。
