2023-11-23
單(dan)(dan)(dan)細(xi)(xi)胞測序技(ji)術(shu)是(shi)指獲取單(dan)(dan)(dan)個(ge)細(xi)(xi)胞遺(yi)傳信息的(de)(de)測序技(ji)術(shu)，即在單(dan)(dan)(dan)個(ge)細(xi)(xi)胞水平上，對(dui)基(ji)因組或轉(zhuan)錄組進(jin)行提取擴增和高(gao)通量測序分析，是(shi)探究(jiu)(jiu)細(xi)(xi)胞異質性的(de)(de)利器。斑馬魚(yu)(yu)作為研(yan)究(jiu)(jiu)器官發(fa)育或免疫調控的(de)(de)重要模式動物，是(shi)目前單(dan)(dan)(dan)細(xi)(xi)胞研(yan)究(jiu)(jiu)最多的(de)(de)水產生物，其(qi)單(dan)(dan)(dan)細(xi)(xi)胞研(yan)究(jiu)(jiu)也為其(qi)它水產生物奠(dian)定了(le)基(ji)礎。今天我們就對(dui)近(jin)期發(fa)表的(de)(de)《Cell Reports》文章進(jin)行解(jie)析，看單(dan)(dan)(dan)細(xi)(xi)胞測序技(ji)術(shu)如(ru)何解(jie)析成年斑馬魚(yu)(yu)不(bu)同器官中巨噬細(xi)(xi)胞和樹突(tu)狀細(xi)(xi)胞的(de)(de)異質性。
1、研究背景 組(zu)(zu)(zu)織(zhi)駐(zhu)留(liu)巨(ju)噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(TRM)和樹突狀(zhuang)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(DC)是天然(ran)免(mian)疫(yi)系(xi)(xi)統的重要組(zu)(zu)(zu)成(cheng)部分，在(zai)免(mian)疫(yi)、組(zu)(zu)(zu)織(zhi)發(fa)育(yu)(yu)、組(zu)(zu)(zu)織(zhi)動態平衡和組(zu)(zu)(zu)織(zhi)修復等(deng)方面(mian)發(fa)揮著關(guan)鍵作(zuo)用(yong)。此外(wai)，巨(ju)噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和樹突狀(zhuang)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)在(zai)組(zu)(zu)(zu)成(cheng)上也呈現出高度(du)異(yi)質性(xing)(xing)。近年來，隨著單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)組(zu)(zu)(zu)學技術的發(fa)展，各種(zhong)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)和器官(guan)中(zhong)均被鑒定出了(le)不(bu)同類型(xing)的巨(ju)噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和樹突狀(zhuang)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)亞群。然(ran)而(er)，目(mu)前對(dui)于(yu)這些不(bu)同組(zu)(zu)(zu)織(zhi)和器官(guan)中(zhong)的亞群細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)在(zai)發(fa)育(yu)(yu)和功能(neng)上的關(guan)系(xi)(xi)仍然(ran)知之(zhi)甚少。由于(yu)其保守(shou)的造(zao)血(xue)(xue)系(xi)(xi)統以及各種(zhong)遺傳(chuan)工具和命(ming)運(yun)圖(tu)譜策(ce)略的可利(li)用(yong)性(xing)(xing)，斑馬(ma)(ma)魚(yu)成(cheng)為研(yan)(yan)究(jiu)造(zao)血(xue)(xue)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)（包(bao)括(kuo)TRM和DC）發(fa)育(yu)(yu)的最佳模(mo)型(xing)系(xi)(xi)統。盡管(guan)斑馬(ma)(ma)魚(yu)巨(ju)噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)已(yi)經被廣泛地(di)研(yan)(yan)究(jiu)了(le)各種(zhong)報告系(xi)(xi)和缺陷系(xi)(xi)，然(ran)而(er)，斑馬(ma)(ma)魚(yu)的TRM異(yi)質性(xing)(xing)和DC細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的生物學特(te)性(xing)(xing)在(zai)很(hen)大程度(du)上仍不(bu)清楚(chu)。本研(yan)(yan)究(jiu)利(li)用(yong)單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)轉(zhuan)錄組(zu)(zu)(zu)測序破(po)譯(yi)成(cheng)年斑馬(ma)(ma)魚(yu)中(zhong)TRM和DC細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的異(yi)質性(xing)(xing)，為進一步(bu)研(yan)(yan)究(jiu)這些細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的發(fa)育(yu)(yu)和功能(neng)特(te)性(xing)(xing)提供了(le)有價值(zhi)的工具。
2、研究思路
3、研究結果 一、成年斑馬魚mpeg1.1+免疫細胞圖譜 為了(le)系統性(xing)評估成年斑馬魚(yu)TRM和(he)DC的異質性(xing)，本研(yan)究利用標記泛髓系細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的轉基(ji)因(yin)斑馬魚(yu)品系Tg (mpeg1.1:DsRedx)，通過流式細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)分選(xuan)富集了(le)6個(ge)不同器(qi)官(guan)(guan)(guan)（3個(ge)屏障(zhang)組(zu)織（表皮(pi)、鰓(sai)、腸）和(he)3個(ge)內臟(zang)器(qi)官(guan)(guan)(guan)（肝、心(xin)臟(zang)和(he)腦(nao)））中的mpeg1.1+細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)進(jin)行(xing)了(le)單(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉錄組(zu)測序（圖(tu)1A）。分別對源于表皮(pi)：2,832鰓(sai)：3,711，腸：3,286；肝：3,248；心(xin)臟(zang)：3,679腦(nao)：2,842個(ge)高質量單(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)進(jin)行(xing)聚類分析，共注釋(shi)出8個(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)亞型（圖(tu)1B、1C）。本研(yan)究發現在所(suo)有(you)的器(qi)官(guan)(guan)(guan)中均注釋(shi)出巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)和(he)DC（圖(tu)1D）。 圖1 實驗設(she)計(ji)和成(cheng)年斑馬魚mpeg1.1+免疫細胞(bao)圖譜(pu)展(zhan)示 二、mpeg1.1+免疫細胞群在各個器官中高度保守 接下來，本研(yan)究(jiu)(jiu)通過(guo)結合來自所(suo)有(you)器官(guan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)mpeg1.1+細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)群(qun)(qun)進(jin)行比較(jiao)分(fen)析(xi)，評(ping)估來自不同(tong)器官(guan)中(zhong)相(xiang)同(tong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)群(qun)(qun)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)錄模式(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)似性(xing)(xing)。Pearson相(xiang)關分(fen)析(xi)顯示(shi)，來自不同(tong)器官(guan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)同(tong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)群(qun)(qun)通常高度相(xiang)關（圖2A），結果表明每個細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)群(qun)(qun)體(ti)都有(you)一個核心(xin)轉(zhuan)(zhuan)錄組(zu)特(te)征(zheng)(zheng)，該特(te)征(zheng)(zheng)定義了(le)(le)(le)(le)其(qi)身份(fen)并賦予了(le)(le)(le)(le)跨器官(guan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)特(te)殊功能。為了(le)(le)(le)(le)確(que)定不同(tong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)群(qun)(qun)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)核心(xin)轉(zhuan)(zhuan)錄組(zu)特(te)征(zheng)(zheng)，本研(yan)究(jiu)(jiu)針對(dui)所(suo)有(you)器官(guan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)亞型進(jin)行了(le)(le)(le)(le)亞型間差異表達(da)基因（DEG）分(fen)析(xi)，發(fa)現巨噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)上(shang)調與吞(tun)噬作用(yong)相(xiang)關的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基因，如fcer1gl，scarb2a, lgals3bpa等(deng)。此外，所(suo)有(you)器官(guan)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)巨噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)DC細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)顯示(shi)出保守的(de)(de)(de)(de)(de)(de)譜系(xi)特(te)異性(xing)(xing)轉(zhuan)(zhuan)錄因子(Tf)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表達(da)，如巨噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)cebpa和(he)mafbb，以及DC中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)id2a和(he)znf366（圖2C）。它們是經過(guo)前期(qi)研(yan)究(jiu)(jiu)對(dui)巨噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)DC細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)跨物種發(fa)育至關重要的(de)(de)(de)(de)(de)(de)調控因子。綜上(shang)所(suo)述，本研(yan)究(jiu)(jiu)定義了(le)(le)(le)(le)斑馬魚器官(guan)中(zhong)不同(tong)mpeg1.1+免(mian)疫細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)群(qun)(qun)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)核心(xin)轉(zhuan)(zhuan)錄組(zu)特(te)征(zheng)(zheng)，并揭(jie)示(shi)了(le)(le)(le)(le)可能參與其(qi)發(fa)育的(de)(de)(de)(de)(de)(de)譜系(xi)特(te)異性(xing)(xing)轉(zhuan)(zhuan)錄因子。 圖2 mpeg1.1+免疫細胞群跨器官特征分析 三、在屏障組織、肝臟和心臟中存在兩個功能不同的巨噬細胞亞群 為了進一步表征巨噬細胞的異質性，本研究提取了所有器官的巨噬細胞，并以更高的分辨率重新進行降維聚類，注釋出lgals3bpb+巨噬細胞和ccl34a4+巨噬細胞，它們在屏障組織、肝臟和心臟中具有不同的分布模式，與lgals3bpb+巨噬細胞不同，ccl34a4+巨噬細胞分別是肝臟中的主要巨噬細胞群和心臟中唯一的巨噬細胞群（圖3A、3B、3C）。亞型間差異表達基因（DEG）分析發現Lgals3bpb+巨噬細胞高水平表達與吞噬作用相關的基因，如lgas 13bpa等，表明其強大的吞噬功能。此外，Lgals3bpb+巨噬細胞高表達炎性趨化因子，如cxcl8a等，表明其具有促炎能力。這些數據表明，lgals3bpb+巨噬細胞具有較強的吞噬和免疫細胞募集能力，具有促炎作用。因此，本研究將lgals3bpb+巨噬細胞群定義為促炎巨噬細胞（pro-inflammatory macrophages）。另一方面，ccl34a4+巨噬細胞最顯著的特征是它們廣泛表達與組織重塑和再生有關的基因，如timp2b等。ccl34a4+巨噬細胞可能在正常器官發育和組織內穩態維持中發揮關鍵作用，故本研究將ccl34a4+巨噬細胞命名為促重塑巨噬細胞（pro-remodeling macrophages）（圖3D、3E、3F）。為了探索這兩個巨噬細胞亞群之間的譜系關系，本研究分析了兩個MP亞群在不同器官中轉錄因子的差異表達水平，結果發現這兩個群體差異表達了許多與巨噬細胞發育和功能特化相關的轉錄因子（圖3G）。綜上，這兩個功能不同的巨噬細胞亞群可能經歷了不同的發育途徑，受到不同的遺傳程序的調節。 圖3 跨器官的兩個不同功能的MP亞群的鑒定 四、斑馬魚體內cDCs和pDCs的存在 為了(le)進(jin)一步表(biao)(biao)(biao)(biao)征樹(shu)突細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)異質性(xing)，本研究(jiu)提(ti)取了(le)所有器官(guan)的(de)(de)(de)樹(shu)突細(xi)(xi)胞(bao)，并以更高(gao)的(de)(de)(de)分辨率重新(xin)進(jin)行降維聚類，注釋出cDCs細(xi)(xi)胞(bao)和(he)(he)pDCs細(xi)(xi)胞(bao)，在屏(ping)障組(zu)織(zhi)、肝臟和(he)(he)心(xin)臟中(zhong)，檢測到一個主(zhu)要的(de)(de)(de)cDC亞群，斑馬(ma)(ma)魚(yu)cDCs高(gao)表(biao)(biao)(biao)(biao)達ccl35(包括ccl35.1和(he)(he)ccl35.2)和(he)(he)核受體4a2b(Nr4a2b)基因，這些(xie)發現(xian)表(biao)(biao)(biao)(biao)明(ming)，斑馬(ma)(ma)魚(yu)cDCs可能(neng)作(zuo)為抗原(yuan)呈遞細(xi)(xi)胞(bao)發揮作(zuo)用，并可能(neng)發揮重要的(de)(de)(de)免疫調節(jie)作(zuo)用。另一方面，斑馬(ma)(ma)魚(yu)pDCs明(ming)顯(xian)表(biao)(biao)(biao)(biao)達高(gao)水平的(de)(de)(de)組(zu)織(zhi)蛋白BB(Ctsbb)和(he)(he)嘌呤(ling)能(neng)受體p2x3a(P2rx3a)基因，表(biao)(biao)(biao)(biao)明(ming)它(ta)(ta)們在抗病毒應答中(zhong)的(de)(de)(de)專門作(zuo)用（圖(tu)4A、4B、4C和(he)(he)4D）,綜上所述(shu)，這些(xie)結果表(biao)(biao)(biao)(biao)明(ming)斑馬(ma)(ma)魚(yu)在成體器官(guan)中(zhong)擁(yong)有功能(neng)保(bao)守的(de)(de)(de)cDCs和(he)(he)pDCs，它(ta)(ta)們構成了(le)有效(xiao)的(de)(de)(de)免疫系統來(lai)應對各種(zhong)病原(yuan)體的(de)(de)(de)入侵。 圖4 屏障組織、肝臟和心臟中cDCs和pDCs的鑒定 五、吞噬性小膠質細胞和調節性DCs存在于成年斑馬魚大腦中 本研究在成年斑馬魚大腦中鑒定了巨噬細胞、小膠質細胞和不同DC細胞群，包括cDCs和pDCs（圖5A）。作為大腦駐留的巨噬細胞，小膠質細胞在調節中樞神經系統（CNS）的發育和功能方面起著至關重要的作用，基因表達分析發現其特異性表達小鼠和人類小膠質細胞的標記基因，如p2ry12、apoeb、apoc1、sall3a和sall3b（圖5B），表明斑馬魚小膠質細胞具有進化保守的轉錄譜。與只有一個cDCs群的屏障組織、肝臟和心臟不同，大腦具有兩個不同的轉錄cDC亞群，cnn3a+cDCs和ccl35+cDCs（圖5C和5D），跨器官分析發現腦內ccl35+cDC亞群更像在其他五個器官中鑒定的常見ccl35+cDCs（圖5E）。與MHCII類相關基因表達較高的ccl35+cDCs相比，腦特異性cnn3a+cDCs表達哺乳動物cDC1標記基因，如xcr1a.1、hepaca2和batf3（圖5F），這表明其與ccl35+cDCs存在潛在的功能和譜系差異。綜上，本研究在斑馬魚腦中發現著一類組織特異的cDC細胞亞群，其高表達了與免疫調節和神經保護相關的基因，預示了這些細胞在中樞神經系統發育和免疫穩態維持中具有重要作用。 圖5 斑馬魚大腦中吞噬性小膠質細胞和調節性DCs的特性
4、研究總結 本研究系統性(xing)地解(jie)析了成年斑馬魚(yu)不(bu)同器官(guan)中巨噬細胞(bao)和(he)樹(shu)突(tu)狀細胞(bao)的異(yi)質性(xing)，且(qie)基于(yu)這些(xie)不(bu)同巨噬細胞(bao)和(he)樹(shu)突(tu)狀細胞(bao)亞群的標志(zhi)基因，建立了多個特異(yi)性(xing)轉基因報告魚(yu)品(pin)系，為深入研究這些(xie)細胞(bao)亞群的發育和(he)功(gong)能提(ti)供了有價值的工具和(he)資(zi)源。
