2023-12-28
2023年12月26日(ri)本公司發布了(le)一款單細胞新(xin)產(chan)品：smRNAPSN-seq，該產(chan)品為(wei)科研(yan)人員提供了(le)一種(zhong)高通量的(de)微生物單細胞轉錄組分(fen)析工具，它將促進未來在鑒定新(xin)的(de)細胞亞群、微生物表型異質性的(de)分(fen)子機(ji)制(耐藥性、刺激環境適應性、代謝(xie)產(chan)物產(chan)量差異等(deng))、微生物演化及微生物與宿主相互作用等(deng)領域(yu)的(de)研(yan)究。下(xia)面讓我們來回顧一下(xia)直播內容。
smRNAPSN-seq實驗流程簡介
smRNAPSN-seq的實驗(yan)流程如圖(tu)1所示。首先(xian)使用甲醛溶液(ye)(ye)對(dui)微(wei)(wei)生物(wu)細胞(bao)(bao)(bao)進(jin)行(xing)(xing)固(gu)定，交聯(lian)胞(bao)(bao)(bao)內(nei)的核酸和蛋白(bai)質(zhi)，以防止mRNA衰解(jie)；然后(hou)對(dui)固(gu)定后(hou)的微(wei)(wei)生物(wu)細胞(bao)(bao)(bao)進(jin)行(xing)(xing)透化，以便進(jin)行(xing)(xing)rRNA的去(qu)(qu)除(chu)；接著進(jin)行(xing)(xing)胞(bao)(bao)(bao)內(nei)rRNA去(qu)(qu)除(chu)，通過(guo)細菌計數(shu)板(ban)確定處理(li)后(hou)的細胞(bao)(bao)(bao)懸液(ye)(ye)濃度并稀釋(shi)至合(he)適濃度。使用10X平臺將(jiang)單個微(wei)(wei)生物(wu)細胞(bao)(bao)(bao)與(yu)膠珠等組分封裝到液(ye)(ye)滴中并進(jin)行(xing)(xing)RT反應，給每(mei)個cDNA上添加(jia)分子標簽(qian)。破油后(hou)對(dui)標記cDNA進(jin)行(xing)(xing)擴增，最后(hou)進(jin)行(xing)(xing)文(wen)庫構建(jian)，上機測(ce)序。
圖1 基于10X平臺(tai)的smRNAPSN-seq的技術路線及實驗(yan)整體流程
微生物單細胞測序數據分析流程及內容
目前smRNAPSN-seq分(fen)析(xi)流程與(yu)內(nei)容：首先需要對獲得(de)的(de)(de)原始數據進(jin)行(xing)(xing)數據質(zhi)控、基(ji)因(yin)組(zu)比(bi)對、10X Barcode和(he)(he)UMI統計及(ji)(ji)生成表達(da)矩陣等基(ji)本分(fen)析(xi)；之后(hou)對過濾后(hou)的(de)(de)數據進(jin)行(xing)(xing)細(xi)胞聚類及(ji)(ji)可(ke)視化等初步分(fen)析(xi)，在(zai)此(ci)基(ji)礎(chu)上(shang)可(ke)進(jin)行(xing)(xing)菌群(qun)(qun)(qun)鑒定、基(ji)因(yin)功能(neng)注(zhu)釋及(ji)(ji)擬時(shi)序分(fen)析(xi)等高級分(fen)析(xi)(如(ru)圖(tu)(tu)(tu)2所示)。為驗證(zheng)smRNAPSN-seq實驗技(ji)術和(he)(he)分(fen)析(xi)流程的(de)(de)可(ke)行(xing)(xing)性(xing)(xing)，我們進(jin)行(xing)(xing)了內(nei)測(ce)實驗，部分(fen)數據分(fen)析(xi)結果(guo)如(ru)圖(tu)(tu)(tu)3所示，UMAP分(fen)析(xi)顯(xian)示出17個細(xi)胞亞(ya)群(qun)(qun)(qun)，其次(ci)每個亞(ya)群(qun)(qun)(qun)間的(de)(de)高表達(da)基(ji)因(yin)和(he)(he)基(ji)因(yin)表達(da)量也出現明顯(xian)差異(圖(tu)(tu)(tu)3a、b、c)。同時(shi)確(que)定每個亞(ya)群(qun)(qun)(qun)的(de)(de)差異表達(da)基(ji)因(yin)并(bing)進(jin)行(xing)(xing)了熱圖(tu)(tu)(tu)分(fen)析(xi)(圖(tu)(tu)(tu)3d)。此(ci)外(wai)，樣本間的(de)(de)數據分(fen)析(xi)顯(xian)示：空白組(zu)與(yu)處理組(zu)的(de)(de)細(xi)胞亞(ya)群(qun)(qun)(qun)比(bi)例(li)和(he)(he)部分(fen)功能(neng)基(ji)因(yin)表達(da)量存(cun)在(zai)顯(xian)著差異(圖(tu)(tu)(tu)3e、f)。以(yi)(yi)上(shang)結果(guo)表明細(xi)菌在(zai)處理的(de)(de)條(tiao)件(jian)下(xia)會(hui)出現異質(zhi)性(xing)(xing)，而傳統的(de)(de)轉錄組(zu)測(ce)序會(hui)掩蓋(gai)這(zhe)種異質(zhi)性(xing)(xing)的(de)(de)存(cun)在(zai)，而smRNAPSN-seq可(ke)以(yi)(yi)發現并(bing)區分(fen)這(zhe)種異質(zhi)性(xing)(xing)。
圖(tu)2 smRNAPSN-seq生信分(fen)析流程
圖3 smRNAPSN-seq內測數據結果展示
微生物單細胞測序項目主要優勢
smRNAPSN-seq是(shi)本(ben)公司自(zi)主研發的(de)基(ji)于10X平臺的(de)創(chuang)新型(xing)微生物單細胞(bao)轉錄組測序技術，具有以下優勢：
具有(you)完(wan)善的(de)質控體系(如圖4a，b)，保證高(gao)質量數據產出(如圖4c)；
具有較低的(de)rRNA占比(如圖4d)，保(bao)證具有較高的(de)數據利(li)用率；
基(ji)于10X微(wei)流控平臺(tai)，具有穩(wen)定的(de)微(wei)流體(ti)分隔體(ti)系；
具有實驗流(liu)程和操作簡單(dan)快捷，減少(shao)人為誤差；
周期可控，更快的項目周期和更好的數據(ju)；
本公(gong)司(si)具有完善(shan)的配套分析流程，從實驗到分析一站式服務。
圖4 微(wei)生(sheng)物單細胞測(ce)序項(xiang)目主要優勢
微生物單細胞轉錄組測序的應用方向
本公司(si)采用(yong)smRNAPSN-seq方(fang)法分(fen)析(xi)了(le)(le)在實驗(yan)處(chu)理條件下(xia)菌(jun)群的(de)(de)(de)異(yi)質性，大(da)大(da)增加了(le)(le)發現稀有罕見細(xi)胞(bao)亞(ya)群的(de)(de)(de)概率(lv)，同(tong)時可(ke)以(yi)根據細(xi)胞(bao)亞(ya)群間(jian)的(de)(de)(de)差異(yi)和(he)高表達基(ji)因(yin)進(jin)行(xing)基(ji)因(yin)選擇敲除(chu)，以(yi)此在單個(ge)(ge)細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)層(ceng)次來探究細(xi)胞(bao)耐藥性和(he)持久性等分(fen)子機制。此外微(wei)生(sheng)物單細(xi)胞(bao)轉錄組測序還(huan)可(ke)應用(yong)于(yu)以(yi)下(xia)研究，如圖5所示。這項技(ji)術(shu)(shu)的(de)(de)(de)出現對(dui)生(sheng)物技(ji)術(shu)(shu)、臨(lin)床(chuang)醫學、農(nong)業微(wei)生(sheng)物等領域(yu)具有深遠(yuan)的(de)(de)(de)影響。在單個(ge)(ge)細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)層(ceng)次破譯細(xi)菌(jun)細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)表達譜(pu)，可(ke)以(yi)使(shi)得科研工(gong)作者們更加了(le)(le)解它們的(de)(de)(de)進(jin)化(hua)起點，從而為相關實驗(yan)的(de)(de)(de)指(zhi)導提(ti)供方(fang)向與指(zhi)引。
圖5 微生物單細(xi)胞轉(zhuan)錄(lu)組測序(xu)的(de)應用方向(xiang)
微生物單細胞轉錄組測序的未來展望
近年來，隨(sui)著微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)單(dan)(dan)細胞(bao)轉(zhuan)錄組(zu)測(ce)序(xu)(xu)文獻陸陸續續的(de)(de)發表，單(dan)(dan)個(ge)菌體或混合菌體的(de)(de)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)單(dan)(dan)細胞(bao)轉(zhuan)錄組(zu)的(de)(de)研究方法已相當成熟，擴寬(kuan)了當前微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)組(zu)學(xue)的(de)(de)相關研究，同時(shi)也(ye)開啟了微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)組(zu)學(xue)測(ce)序(xu)(xu)新篇(pian)章，也(ye)顯(xian)示(shi)了科研工(gong)作者們(men)對于微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)組(zu)學(xue)研究的(de)(de)追求，對于微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)單(dan)(dan)細胞(bao)轉(zhuan)錄組(zu)測(ce)序(xu)(xu)技術(shu)有著更高(gao)的(de)(de)期(qi)望。因此環(huan)(huan)境樣(yang)品(pin)(pin)的(de)(de)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)單(dan)(dan)細胞(bao)轉(zhuan)錄組(zu)測(ce)序(xu)(xu)成為了下(xia)一個(ge)研究熱點。而(er)環(huan)(huan)境樣(yang)品(pin)(pin)具有復(fu)雜的(de)(de)理(li)化性質、豐富(fu)的(de)(de)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)種類，對于實驗樣(yang)品(pin)(pin)的(de)(de)預處理(li)存在巨大的(de)(de)考驗，后期(qi)我(wo)們(men)會進(jin)一步克服相關的(de)(de)難(nan)點，完(wan)善(shan)環(huan)(huan)境樣(yang)品(pin)(pin)的(de)(de)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)單(dan)(dan)細胞(bao)轉(zhuan)錄組(zu)測(ce)序(xu)(xu)技術(shu)，為微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)組(zu)學(xue)的(de)(de)發展提供更大的(de)(de)助力。
