2023-12-29
背景
身(shen)體能(neng)(neng)夠(gou)識別抗(kang)原(yuan)(yuan)并(bing)通過(guo)選(xuan)擇性擴(kuo)增免(mian)疫細(xi)(xi)胞(bao)(bao)和選(xuan)定細(xi)(xi)胞(bao)(bao)內的(de)突變(bian)來產生(sheng)免(mian)疫反應，從而保(bao)護(hu)自己免(mian)受(shou)病毒、細(xi)(xi)菌(jun)和腫(zhong)瘤(liu)等抗(kang)原(yuan)(yuan)的(de)侵害。通過(guo)繪制響(xiang)應抗(kang)原(yuan)(yuan)暴露的(de)同源 BCR 和 TCR 的(de)演變(bian)，能(neng)(neng)夠(gou)分析生(sheng)物樣本（例(li)如(ru)抽(chou)血或(huo)活檢）中單個免(mian)疫細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)歷史。這段歷史反映了(le)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)同源受(shou)體如(ru)何響(xiang)應各種抗(kang)原(yuan)(yuan)而進(jin)化。 BCR 和 TCR 鏈的(de)多(duo)樣性，包含 V、D 和/或 J 片段的(de)各種組合(he)，豐富了免疫庫，以(yi)抵御多(duo)種病(bing)原體。下圖(tu)說明了BCR克隆型的(de)概(gai)念。類(lei)似的(de)概(gai)念也(ye)適用于TCR，但沒有(you)體細胞超突(tu)變(bian)。
10X單細胞免疫組庫克隆分型概述 克隆型分組(zu)的過程就是一(yi)群細(xi)(xi)胞(bao)被放置在(zai)(zai)一(yi)個(ge)克隆組(zu)中(zhong)(zhong)的過程。每個(ge)克隆型都由一(yi)個(ge)完全重排的共(gong)同(tong)祖先的所有(you)后代組(zu)成。在(zai)(zai)此(ci)(ci)過程中(zhong)(zhong)，某些(xie)barcode被標記為(wei)可(ke)能的偽影并被過濾掉，且它們不再被稱為(wei)細(xi)(xi)胞(bao)。T細(xi)(xi)胞(bao)受(shou)體(ti)(ti)(TCR)缺乏體(ti)(ti)細(xi)(xi)胞(bao)超(chao)突變(SHM)，相同(tong)的克隆型的細(xi)(xi)胞(bao)會產生(sheng)相同(tong)的V(D)J轉錄(lu)本(ben)。完全重新排列的B細(xi)(xi)胞(bao)受(shou)體(ti)(ti)(BCR)會經歷SHM，這可(ke)以增(zeng)加抗(kang)原親和力。因此(ci)(ci)，對(dui)于BCR，克隆型中(zhong)(zhong)細(xi)(xi)胞(bao)的V(D)J轉錄(lu)本(ben)在(zai)(zai)任何位置都可(ke)能有(you)所不同(tong)，這也為(wei)B細(xi)(xi)胞(bao)克隆型的定(ding)義增(zeng)加了很大的難度。
克隆型定義的方法和規則 克隆型定義采(cai)用Cell Ranger 和enclone兩個軟(ruan)件相結(jie)合的方法,具體如下圖所(suo)示(shi)。 ■ 從donor上確定V(D)J基因的germline 序列，作為(wei)call SHMs的參考。 ■ 精確(que)的(de)(de)亞(ya)克隆(long)(long)分組(zu)：如(ru)果細胞(bao)具有相(xiang)同的(de)(de)V(D)J基因轉錄本和一致的(de)(de)C區基因，這(zhe)些(xie)細胞(bao)可(ke)以歸(gui)為一群精確(que)的(de)(de)亞(ya)克隆(long)(long)中(zhong)。此步只考慮(lv)productive contigs，不考慮(lv)5端(duan)UTR區域。 ■ 將精(jing)確(que)的(de)亞克(ke)隆(long)(long)組合并為克(ke)隆(long)(long)：具有(you)共同差(cha)異和最小 CDR3 突變等既定(ding)標準的(de)兩個細胞被認(ren)為屬于同一克(ke)隆(long)(long)類型。詳細規(gui)則如下： 兩個亞(ya)克隆組相(xiang)應鏈VJ基(ji)因(yin)長(chang)度相(xiang)同(tong)、CDR3片段長(chang)度相(xiang)同(tong)。 在兩個(ge)完全(quan)相同的亞克隆之間(jian)尋找共同的突變(bian)，即對于(yu)兩個(ge)確切(qie)的亞克隆型，V基因使用(yong)donor序列(可以用(yong)來排除germline突變(bian))，J基因使用(yong)通用(yong)序列。 CDR3 的(de)核苷酸(suan)同一性至(zhi)少達到85%。在不(bu)同的(de)確切亞克(ke)隆型之(zhi)間識別交界區外 V-J 序(xu)列中(zhong)共享體細胞(bao)高(gao)突變（SHM）。根據設定的(de)閾(yu)值(zhi)，CDR3 突變過多的(de)鏈將被剔除。其他(ta)標準見//10xgenomics.github.io/enclone/pages/auto/help.how.html ■ 對克隆型和barcode的其他過濾
克隆型定義的結果 每個克(ke)隆型的詳細描述信息：
參考： //support.10xgenomics.com/single-cellvdj/software/pipelines/latest/algorithms/clonotyping //10xgenomics.github.io/enclone/pages/auto/help.glossary.html
