2024-01-02
好消息！
Greengenes2數據庫(ku)現已加入派(pai)森諾微生(sheng)物多樣(yang)性(xing)的流(liu)程中！！！
在高(gao)通(tong)量(liang)測序中(zhong)，使(shi)用(yong)16S rRNA擴(kuo)增子(zi)方(fang)法和宏基因(yin)組學方(fang)法的研究通(tong)常會產生不同的結果，這通(tong)常被歸因(yin)于PCR擴(kuo)增偏差，目前(qian)還沒(mei)有很好地(di)方(fang)法解(jie)決(jue)這一問題。 2023年(nian)7月(yue)，Nature Biotechnology（IF: 46.9）發表(biao)(biao)了(le)(le)Daniel McDonald（通(tong)訊作者Rob Knight）等人的(de)(de)文章(zhang)，引入(ru)了(le)(le)Greengenes2。這是一個參考樹(shu)，通(tong)過將(jiang)序列插入(ru)到全基(ji)因(yin)組(zu)(zu)系統發育(yu)樹(shu)中，將(jiang)基(ji)因(yin)組(zu)(zu)和(he)16S rRNA數據(ju)庫(ku)統一在一個一致(zhi)的(de)(de)、集成的(de)(de)資源(yuan)中。結(jie)果表(biao)(biao)明從(cong)相同的(de)(de)樣本中生成的(de)(de)16S rRNA和(he)宏基(ji)因(yin)組(zu)(zu)數據(ju)在主坐標空間、分(fen)類學和(he)表(biao)(biao)型效應大小上是一致(zhi)的(de)(de)。此外，Greengenes2數據(ju)庫(ku)的(de)(de)系統發育(yu)覆(fu)蓋(gai)率遠大于(yu)SILVA、Greengenes和(he)GTDB等數據(ju)庫(ku)。Greengenes2數據(ju)庫(ku)將(jiang)會是微生物組(zu)(zu)研究的(de)(de)一個利器(qi)。
鳥(niao)槍法宏基因(yin)(yin)組測(ce)序(xu)(xu)和(he)(he)(he)(he)16S rRNA基因(yin)(yin)擴增子測(ce)序(xu)(xu)研(yan)究在微(wei)(wei)生物(wu)組研(yan)究中被(bei)廣泛使(shi)用(yong)，但使(shi)用(yong)這(zhe)些方法的(de)研(yan)究者通常發現它們的(de)結果(guo)差異較(jiao)大。這(zhe)種(zhong)跨(kua)方法的(de)標(biao)準化(hua)不(bu)(bu)足限制了微(wei)(wei)生物(wu)組用(yong)于可重復性(xing)生物(wu)標(biao)志物(wu)的(de)發現。造成(cheng)這(zhe)樣(yang)結果(guo)的(de)一個關鍵原(yuan)因(yin)(yin)是(shi)二者依賴(lai)于不(bu)(bu)同的(de)分類和(he)(he)(he)(he)系(xi)統發育。例如，Web of Life ( WoL ) 和(he)(he)(he)(he)Genome Taxonomy Database ( GTDB ) 提(ti)供(gong)的(de)全基因(yin)(yin)組樹(shu)只覆蓋了一小部(bu)分已知的(de)細(xi)菌(jun)和(he)(he)(he)(he)古細(xi)菌(jun)，而(er)SILVA和(he)(he)(he)(he)Greengenes則較(jiao)為(wei)全面，但通常無(wu)法鏈(lian)接到基因(yin)(yin)組。 本研究作者(zhe)利(li)用迭代的(de)方法產(chan)生一(yi)個單一(yi)的(de)大規模(mo)參考樹(shu)，統一(yi)這些不同的(de)數據層(基因組(zu)和16S rRNA)，即為Greengenes2。數據來源(yuan)及主要(yao)處理流程如下： 1、首先(xian)從NCBI中均勻采(cai)樣了(le)15,953個(ge)細(xi)菌(jun)和古細(xi)菌(jun)基(ji)因(yin)(yin)組的(de)(de)全基(ji)因(yin)(yin)組，并使(shi)用新的(de)(de)工作(zuo)(zuo)流(liu)程(cheng) uDance總結 380 個(ge)全局標記基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)進化軌(gui)跡，重建(jian)了(le)準(zhun)確(que)的(de)(de)系統發(fa)育樹。這項工作(zuo)(zuo)即(ji)WoL版(ban)本2 ( WoL2 )，是(shi)對(dui)之前發(fa)布(bu)的(de)(de)WoL1（10,575個(ge)基(ji)因(yin)(yin)組）的(de)(de)重要升級。 2、進一步添(tian)加了來自(zi)Living Tree Project（LTP）2022 年1月發布的(de)18,356個全(quan)長16S rRNA序列、來自(zi)Karst等人和地球微生物(wu)組(zu)計劃500（EMP500）的(de)1,725,274個接近(jin)完整的(de)16S rRNA基(ji)因以(yi)及所有全(quan)長使用(yong)uDance v1.1.0將GTDB r207的(de) 16S rRNA序列定(ding)位到基(ji)于基(ji)因組(zu)的(de)主干，生成(cheng)明確(que)表示的(de) 16S rRNA的(de)基(ji)因組(zu)支持的(de)系統發育。 3、使用支(zhi)持深度(du)學習的系統發育放置插入(ru)了來(lai)自(zi)Qiita的23,113,447個短V4 16S rRNA Deblur v1.1.0擴增子序(xu)列變體(ti)（ASV）（檢索于(yu)2021年12月14日）以及來(lai)自(zi)SILVA v138的線粒體(ti)和葉(xie)綠體(ti)16S rRNA。這(zhe)一(yi)步代表來(lai)自(zi)Qiita超(chao)過(guo)300,000個公共和私人樣本的ASV，包(bao)括整個環(huan)境微生(sheng)物組(zu)計劃EMP和美國腸道(dao)計劃（American Gut Project/Microsetta，圖 1a）。 4、使用(yong)uDance確保(bao)基于基因組的(de)關(guan)(guan)系保(bao)持固定，并推斷全(quan)長(chang)16S rRNA序列(lie)之間的(de)關(guan)(guan)系。對(dui)于短片段(duan)，保(bao)持基因組和(he)全(quan)長(chang)關(guan)(guan)系固定，并彼(bi)此(ci)獨立地(di)插入片段(duan)。經過對(dui)片段(duan)放置進(jin)行重復刪除和(he)質量控制后，生成了一棵涵蓋來自31個不同(tong)地(di)球微生物(wu)組項目本體論(lun)（EMP Ontology 3，EMPO3）環境的(de)21,074,442個序列(lie)的(de)樹，其中(zhong)46.5%的(de)物(wu)種(zhong)(zhong)級葉子(zi)被完整(zheng)的(de)基因組覆蓋。使用(yong)tax2tree v1.1將(jiang)分類(lei)標簽(qian)修(xiu)飾到系統發育上。物(wu)種(zhong)(zhong)注釋(shi)(shi)使用(yong)GTDB r207，并結合2022年1月(yue)發布的(de)LTP。分類(lei)學以(yi)GTDB為優(you)先(xian)順序進(jin)行協調(diao)，包(bao)括保(bao)留GTDB的(de)多系標簽(qian)等。物(wu)種(zhong)(zhong)注釋(shi)(shi)將(jiang)使用(yong)最新(xin)版本的(de)GTDB和(he)LTP每6個月(yue)更(geng)新(xin)一次。 圖1 ｜ Greengenes2數據庫覆蓋信息以及使用Greengenes2實現16S擴增子與宏基因組結果一致性。 a：Greengenes2系(xi)統發育，ASV多分支折(zhe)疊；樹枝末端顏色表(biao)示在美國腸道計劃（AGP）、地球微生物組(zu)計劃（EMP），兩者(zhe)都有（Both）或兩者(zhe)都沒有（Neither）。外圈顏色代(dai)表(biao)Top 20門(men)； b：進(jin)化樹同a，使用是否存(cun)在于SILVA 138的(de)最佳(jia)BLAST比對結果進(jin)行著色(se)。外圈顏色(se)與樹枝末端顏色(se)相同。 c：EMP樣本(ben)和通(tong)過ASV片段放置(zhi)添加到樹中的新分(fen)支(zhi)長(chang)度(du)的量（通(tong)過總主干分(fen)支(zhi)長(chang)度(du)歸一化）。 d：配對的16S V4 rRNA ASV和全基(ji)因組鳥槍樣本的Bray–Curtis PCoA展(zhan)示(shi)（數(shu)據(ju)來自(zi)The Microsetta Initiative的THDMI子集）； e：數據(ju)(ju)同d，但用(yong)屬水平數據(ju)(ju)計算Bray-Curtis； f：數(shu)據(ju)同d、e，但在ASV和(he)基因組標識符水平上(shang)計算加權UniFrac。
Greengenes2的(de)(de)(de)(de)系統(tong)發(fa)(fa)育覆蓋率遠大于(yu)SILVA、Greengenes和(he)(he)GTDB等。過(guo)去比(bi)對(dui)16S和(he)(he)宏基因(yin)組(zu)(zu)(zu)數據(ju)集的(de)(de)(de)(de)各種努(nu)力仍然導致(zhi)分布不(bu)重疊，并且只有普氏分析（Procrustes）等技(ji)術才能顯示(shi)結果(guo)之間的(de)(de)(de)(de)關系。在(zai)兩個(ge)大型(xing)人(ren)(ren)類糞(fen)便隊列中，16S和(he)(he)宏基因(yin)組(zu)(zu)(zu)數據(ju)都(dou)是在(zai)同一(yi)(yi)(yi)(yi)樣本(ben)(ben)上生成的(de)(de)(de)(de)，Bray-Curtis（非系統(tong)發(fa)(fa)育）排序(xu)在(zai)特(te)征水平上無法一(yi)(yi)(yi)(yi)致(zhi)（圖(tu)1d），并且在(zai)特(te)征屬水平合(he)并仍表現不(bu)佳（圖(tu)1e）。而UniFrac（一(yi)(yi)(yi)(yi)種系統(tong)發(fa)(fa)育方(fang)法）與Greengenes2樹(shu)一(yi)(yi)(yi)(yi)起使用提供了更好的(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)(yi)(yi)致(zhi)性（圖(tu)1f）。對(dui)非人(ren)(ren)類環境的(de)(de)(de)(de)適用性，在(zai)16S和(he)(he)來(lai)自EMP的(de)(de)(de)(de)宏基因(yin)組(zu)(zu)(zu)數據(ju)的(de)(de)(de)(de)特(te)征級別上計(ji)算了Bray-Curtis和(he)(he)加權UniFrac。本(ben)(ben)研究也測試了環境類型(xing)樣本(ben)(ben)，與人(ren)(ren)源數據(ju)一(yi)(yi)(yi)(yi)樣，Greengenes2系統(tong)發(fa)(fa)育使用后結果(guo)具有更好的(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)(yi)(yi)致(zhi)性。 作(zuo)者發現(xian)(xian)，每(mei)個樣本的(de)(de)(de)宏基因組和16S分(fen)類相(xiang)對(dui)豐度分(fen)布(bu)甚(shen)(shen)至與物(wu)(wu)種(zhong)水(shui)(shui)平(ping)(ping)(ping)(ping)一致(zhi)。首(shou)先(xian)使用Woltka流程(cheng)計算了宏基因組數據的(de)(de)(de)分(fen)類配(pei)置(zhi)文件。使用來自(zi)q2-feature-classifier（v2022.2）的(de)(de)(de)樸素貝(bei)葉斯分(fen)類器將每(mei)個級別的(de)(de)(de)GTDB r207分(fen)類結(jie)果與SILVA v138（圖2a）或(huo)下至物(wu)(wu)種(zhong)水(shui)(shui)平(ping)(ping)(ping)(ping)與Greengenes v13_8（圖2b）進(jin)行(xing)比較(jiao)（無(wu)法進(jin)行(xing)物(wu)(wu)種(zhong)水(shui)(shui)平(ping)(ping)(ping)(ping)的(de)(de)(de)一致(zhi)性(xing)比較(jiao)）。相(xiang)比之下，Greengenes2在屬水(shui)(shui)平(ping)(ping)(ping)(ping)提供了極好(hao)(hao)的(de)(de)(de)一致(zhi)性(xing)（Pearson r = 0.85），在物(wu)(wu)種(zhong)水(shui)(shui)平(ping)(ping)(ping)(ping)上提供了良好(hao)(hao)的(de)(de)(de)一致(zhi)性(xing)（Pearson r = 0.65）（圖2c）。有趣的(de)(de)(de)是，這棵(ke)樹(shu)現(xian)(xian)在已經足夠完整，以至于精確(que)匹配(pei)16S ASV然(ran)后從(cong)樹(shu)上讀(du)取物(wu)(wu)種(zhong)注釋甚(shen)(shen)至比樸素貝(bei)葉斯分(fen)類器表(biao)現(xian)(xian)得更好(hao)(hao)（屬水(shui)(shui)平(ping)(ping)(ping)(ping) r = 0.54和物(wu)(wu)種(zhong)水(shui)(shui)平(ping)(ping)(ping)(ping) r = 0.84）。 總之，這些結(jie)果表明，使(shi)用一致的(de)、綜合(he)的(de)分(fen)類資源顯著(zhu)提高了(le)使(shi)用不(bu)同數據(ju)類型的(de)微生(sheng)物組研究的(de)可重復性。 圖2 ｜ 16S rRNA ASVs和宏(hong)基因組數據之間(jian)的分類(lei)學和效應大小一致性。 a-c：飲食(shi)微生物組計劃的16S和全基因組宏基因組圖譜(pu)之間的樣本分類學(xue)比較。實線表示中位(wei)數，虛線表示第(di)25和第(di)75個百分位(wei)數。 d-e：用Evident對來自飲食(shi)微生物組計劃的(de)成對16S和全(quan)基(ji)因組鳥(niao)槍樣本(ben)(ben)進行的(de)效應大小(xiao)計算(suan)。使用16S的(de)ASV和鳥(niao)槍樣本(ben)(ben)的(de)基(ji)因組標(biao)識符以(yi)最大分辨率進行計算(suan)。這(zhe)里顯示的(de)數據是(shi)人類腸道微生物組樣本(ben)(ben)。星(xing)號表示特定的(de)變量。
參考文獻 McDonald D, Jiang Y, Balaban M, et al. Greengenes2 unifies microbial data in a single reference tree[J]. Nature Biotechnology, 2023.
