2024-01-05
隨(sui)著單細(xi)(xi)胞測(ce)序技(ji)術(shu)的(de)快速發展，單細(xi)(xi)胞測(ce)序的(de)應(ying)用范(fan)圍(wei)越(yue)來(lai)越(yue)廣泛，從動物(wu)(wu)、植物(wu)(wu)領域(yu)逐(zhu)漸觸(chu)及微(wei)生物(wu)(wu)領域(yu)，微(wei)生物(wu)(wu)包含(han)細(xi)(xi)菌、真菌、病毒(du)等生物(wu)(wu)，其中應(ying)用于原(yuan)核生物(wu)(wu)的(de)單細(xi)(xi)胞測(ce)序技(ji)術(shu)具有(you)mRNA豐度(du)低、轉錄本不穩定、拷貝數低、缺乏polyA尾(wei)等因(yin)素，除此之(zhi)外原(yuan)核細(xi)(xi)胞體積小，細(xi)(xi)胞外包裹有(you)厚且復雜的(de)細(xi)(xi)胞膜和細(xi)(xi)胞壁，較難裂解。而針(zhen)對以上的(de)部分技(ji)術(shu)難點，本公司具有(you)完善的(de)質控體系。
1、微生物細(xi)胞(bao)樣(yang)品(pin)狀態(tai)鑒定 寄送的微(wei)(wei)生物(wu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)樣品(pin)(pin)(pin)(pin)需(xu)要(yao)對(dui)其樣品(pin)(pin)(pin)(pin)狀態(死活率、RNA狀態等)進(jin)行(xing)鑒定(ding)。首先對(dui)樣品(pin)(pin)(pin)(pin)中取出(chu)的一(yi)部分細(xi)(xi)胞(bao)(bao)懸液進(jin)行(xing)熒(ying)光染料染色(se)，在熒(ying)光顯微(wei)(wei)鏡下(xia)觀察，發出(chu)綠(lv)色(se)熒(ying)光的細(xi)(xi)胞(bao)(bao)為活細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(圖(tu)(tu)1a)，發出(chu)紅色(se)熒(ying)光的細(xi)(xi)胞(bao)(bao)為死細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(圖(tu)(tu)1b)，使(shi)用軟件工具將活細(xi)(xi)胞(bao)(bao)圖(tu)(tu)和死細(xi)(xi)胞(bao)(bao)圖(tu)(tu)合(he)并在一(yi)起計算細(xi)(xi)胞(bao)(bao)活性(xing)(活細(xi)(xi)胞(bao)(bao)數量(liang)/總(zong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)數量(liang)的比值)(圖(tu)(tu)1c)。其次需(xu)要(yao)對(dui)微(wei)(wei)生物(wu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)總(zong)RNA進(jin)行(xing)提取并檢測(ce)(圖(tu)(tu)2)，保(bao)證樣品(pin)(pin)(pin)(pin)RNA具有較好的完整性(xing)(RIN > 8)。 圖(tu)1 微生(sheng)物細胞死(si)活率質檢圖(tu) 圖2 微(wei)生(sheng)物細胞RNA 2100質(zhi)檢圖 2、微生物(wu)細胞的(de)固定 針(zhen)對(dui)原核(he)(he)細(xi)胞(bao)轉(zhuan)錄本不穩(wen)定(ding)，半衰期短的(de)特(te)點，需(xu)要對(dui)微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)細(xi)胞(bao)進行固定(ding)，以(yi)此(ci)(ci)來鎖定(ding)微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)細(xi)胞(bao)的(de)瞬(shun)時(shi)狀態(tai)，提高轉(zhuan)錄本的(de)捕獲效率(lv)。目前市場上(shang)常(chang)用(yong)(yong)的(de)細(xi)胞(bao)固定(ding)試劑有甲(jia)醛(quan)(quan)、乙醛(quan)(quan)、甲(jia)醇、丙(bing)酮、福爾(er)馬林(lin)和氯醛(quan)(quan)酸(suan)(suan)，其(qi)中甲(jia)醇、乙醛(quan)(quan)、丙(bing)酮和氯醛(quan)(quan)酸(suan)(suan)的(de)交聯(lian)(lian)作用(yong)(yong)較弱，無法很好地將蛋白(bai)質(zhi)與核(he)(he)酸(suan)(suan)緊密地交聯(lian)(lian)，而甲(jia)醛(quan)(quan)和福爾(er)馬林(lin)具有較強(qiang)的(de)交聯(lian)(lian)作用(yong)(yong)，但福爾(er)馬林(lin)主(zhu)要用(yong)(yong)于(yu)(yu)組織固定(ding)且(qie)揮發性較強(qiang)，因(yin)此(ci)(ci)甲(jia)醛(quan)(quan)固定(ding)微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)細(xi)胞(bao)是最(zui)佳的(de)選擇。甲(jia)醛(quan)(quan)可以(yi)與細(xi)胞(bao)內的(de)蛋白(bai)質(zhi)發生(sheng)(sheng)交聯(lian)(lian)反應(ying)，固定(ding)細(xi)胞(bao)的(de)結構(gou)和形態(tai)，便于(yu)(yu)微流(liu)控上(shang)機；可以(yi)與核(he)(he)酸(suan)(suan)中的(de)堿基(ji)發生(sheng)(sheng)交聯(lian)(lian)反應(ying)，防(fang)止核(he)(he)酸(suan)(suan)降解和流(liu)失。 3、微生物(wu)細胞(bao)透化效果檢測 甲醛固(gu)定(ding)(ding)(ding)對(dui)于(yu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)而(er)(er)(er)言，可(ke)以(yi)使(shi)得細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)和(he)(he)(he)脂質(zhi)(zhi)(zhi)分子交(jiao)聯固(gu)定(ding)(ding)(ding)，從(cong)而(er)(er)(er)保(bao)持細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)完(wan)整性(xing)和(he)(he)(he)穩(wen)(wen)定(ding)(ding)(ding)性(xing)；對(dui)于(yu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)壁(bi)(bi)而(er)(er)(er)言，可(ke)以(yi)使(shi)得壁(bi)(bi)上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)多糖(tang)和(he)(he)(he)蛋白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)交(jiao)聯固(gu)定(ding)(ding)(ding)，增加細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)壁(bi)(bi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)穩(wen)(wen)定(ding)(ding)(ding)性(xing)和(he)(he)(he)硬(ying)度，并且不(bu)(bu)(bu)會對(dui)細(xi)(xi)(xi)(xi)菌(jun)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)壁(bi)(bi)和(he)(he)(he)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)造成物理損(sun)傷，因(yin)此固(gu)定(ding)(ding)(ding)后(hou)(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)生物細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)需(xu)要(yao)進行(xing)(xing)(xing)透化(hua)處(chu)(chu)理以(yi)便(bian)后(hou)(hou)期進行(xing)(xing)(xing)rRNA去(qu)除(chu)和(he)(he)(he)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)裂(lie)解。細(xi)(xi)(xi)(xi)菌(jun)透化(hua)采用含有溶(rong)(rong)菌(jun)酶(mei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)試劑(ji)進行(xing)(xing)(xing)孵(fu)(fu)育(yu)處(chu)(chu)理，因(yin)微(wei)(wei)生物細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)種類(lei)不(bu)(bu)(bu)同，其(qi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)和(he)(he)(he)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)壁(bi)(bi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)復雜程度也不(bu)(bu)(bu)一(yi)樣(yang)，因(yin)此需(xu)要(yao)不(bu)(bu)(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)透化(hua)參數與條件，而(er)(er)(er)透化(hua)效果的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)好(hao)(hao)壞關系(xi)到rRNA去(qu)除(chu)和(he)(he)(he)mRNA捕獲的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)情況，只有構(gou)建相應的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)透化(hua)質(zhi)(zhi)(zhi)控體系(xi)才(cai)能(neng)保(bao)證穩(wen)(wen)定(ding)(ding)(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)數據產出。透化(hua)效果的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)好(hao)(hao)壞主要(yao)取(qu)決于(yu)與rRNA結(jie)合(he)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)寡核苷酸序列是否可(ke)以(yi)順(shun)利(li)進入(ru)胞(bao)內進行(xing)(xing)(xing)rRNA消除(chu)反應，而(er)(er)(er)我們采用帶有綠色熒(ying)光(guang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)特異結(jie)合(he)保(bao)守基因(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)寡核苷酸序列與透化(hua)菌(jun)體進行(xing)(xing)(xing)孵(fu)(fu)育(yu)雜交(jiao)，根據熒(ying)光(guang)強(qiang)(qiang)(qiang)度判斷透化(hua)效果。以(yi)某一(yi)細(xi)(xi)(xi)(xi)菌(jun)為(wei)實驗(yan)對(dui)象，對(dui)透化(hua)質(zhi)(zhi)(zhi)控體系(xi)進行(xing)(xing)(xing)驗(yan)證：首先是打(da)孔試劑(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)打(da)孔效果的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)鑒(jian)(jian)定(ding)(ding)(ding)，通過(guo)在熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)(wei)鏡下觀察未打(da)孔與打(da)孔樣(yang)品的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)熒(ying)光(guang)強(qiang)(qiang)(qiang)度來判定(ding)(ding)(ding)打(da)孔的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)效果，如圖(tu)(tu)(tu)3所示，左(zuo)(zuo)圖(tu)(tu)(tu)為(wei)打(da)孔鏡檢(jian)圖(tu)(tu)(tu)，右(you)圖(tu)(tu)(tu)為(wei)未打(da)孔鏡檢(jian)圖(tu)(tu)(tu)。其(qi)次是溶(rong)(rong)菌(jun)酶(mei)試劑(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)不(bu)(bu)(bu)同孵(fu)(fu)育(yu)時(shi)間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)效果鑒(jian)(jian)定(ding)(ding)(ding)，通過(guo)在熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)(wei)鏡下觀察樣(yang)品的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)熒(ying)光(guang)強(qiang)(qiang)(qiang)度來判斷溶(rong)(rong)菌(jun)酶(mei)試劑(ji)不(bu)(bu)(bu)同孵(fu)(fu)育(yu)時(shi)間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)處(chu)(chu)理效果，如圖(tu)(tu)(tu)4所示，分別為(wei)溶(rong)(rong)菌(jun)酶(mei)試劑(ji)處(chu)(chu)理1min(左(zuo)(zuo)上(shang))，5min(右(you)上(shang))，10min(左(zuo)(zuo)下)和(he)(he)(he)15min(右(you)下)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)鏡檢(jian)圖(tu)(tu)(tu)，其(qi)中溶(rong)(rong)菌(jun)酶(mei)試劑(ji)處(chu)(chu)理10min時(shi)熒(ying)光(guang)強(qiang)(qiang)(qiang)度最(zui)強(qiang)(qiang)(qiang)，透化(hua)效果最(zui)好(hao)(hao)。 圖(tu)3 打孔效果鏡檢(jian)圖(tu) 圖(tu)4 溶菌酶試劑(ji)不同孵育時(shi)間的效(xiao)果鏡檢圖(tu) 不(bu)同(tong)的(de)微(wei)生物(wu)樣品(pin)，不(bu)同(tong)的(de)細(xi)胞結(jie)構，采用(yong)本公司的(de)質控體系對不(bu)同(tong)的(de)微(wei)生物(wu)樣品(pin)進(jin)行固定(ding)與透(tou)化參數的(de)測(ce)試，從(cong)而不(bu)斷地積累(lei)實驗樣品(pin)處(chu)理經驗，為更多的(de)科研工作者們(men)提供更加完善、更加快速的(de)技術服務。
