2024-01-11
細(xi)菌核(he)糖(tang)體核(he)糖(tang)核(he)酸(rRNA)是存在(zai)于細(xi)菌細(xi)胞中的(de)(de)一類RNA分子，約占總(zong)RNA 80% - 98%的(de)(de)比(bi)例，主要(yao)由(you)三個(ge)不(bu)同長度的(de)(de)部分組成(cheng)：5S rRNA(120nt)、16S rRNA(1542nt)、23S rRNA(2906nt)，rRNA作為(wei)(wei)核(he)糖(tang)體中起(qi)(qi)主要(yao)作用的(de)(de)結(jie)(jie)(jie)構成(cheng)分，其主要(yao)作用是：1、具有肽酰(xian)轉移酶的(de)(de)活性；2、為(wei)(wei)tRNA提供結(jie)(jie)(jie)合(he)點；3、為(wei)(wei)多(duo)種蛋白(bai)(bai)質(zhi)合(he)成(cheng)因子提供結(jie)(jie)(jie)合(he)位點；4、在(zai)蛋白(bai)(bai)質(zhi)合(he)成(cheng)起(qi)(qi)始時，參(can)與同mRNA選擇性的(de)(de)結(jie)(jie)(jie)合(he)以(yi)及在(zai)肽鏈的(de)(de)延伸(shen)中與mRNA結(jie)(jie)(jie)合(he)。rRNA在(zai)蛋白(bai)(bai)質(zhi)合(he)成(cheng)過程中扮演著關鍵(jian)的(de)(de)角色，高含量的(de)(de)rRNA可以(yi)確保(bao)蛋白(bai)(bai)質(zhi)合(he)成(cheng)過程的(de)(de)高效進行。
雖然rRNA在蛋白(bai)質合(he)成過(guo)程中(zhong)起到關鍵(jian)作用(yong)，但是在研究遺傳調控機制(zhi)或(huo)NGS測(ce)序技術(shu)等方(fang)面(mian)，還是要看信使(shi)核糖核酸(mRNA)。而在微(wei)生(sheng)物單(dan)細胞(bao)轉(zhuan)錄(lu)組測(ce)序中(zhong)，由于原(yuan)核生(sheng)物mRNA缺乏PolyA尾，無法(fa)效仿真(zhen)核生(sheng)物進行mRNA的(de)捕獲，從而選(xuan)擇進行rRNA的(de)消減(jian)。目前應用(yong)于微(wei)生(sheng)物單(dan)細胞(bao)轉(zhuan)錄(lu)組測(ce)序的(de)rRNA去(qu)(qu)除(chu)方(fang)法(fa)主要有：基于探針的(de)RNase H介(jie)導的(de)rRNA去(qu)(qu)除(chu)方(fang)法(fa)；基于CRISPR-Cas9的(de)rRNA去(qu)(qu)除(chu)方(fang)法(fa)。
基于(yu)探針的(de)RNase H介(jie)導的(de)rRNA去除方法
RNase H是一種(zhong)核糖核酸(suan)內切(qie)酶(mei)，可特(te)異(yi)性切(qie)割DNA、RNA雜交雙鏈(lian)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)RNA分子，同時保(bao)證DNA序(xu)(xu)列的(de)(de)(de)(de)完整性。針(zhen)(zhen)對細(xi)(xi)(xi)菌(jun)rRNA序(xu)(xu)列設(she)計的(de)(de)(de)(de)高(gao)特(te)異(yi)性DNA探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)，通過DNA探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)與(yu)細(xi)(xi)(xi)菌(jun)rRNA序(xu)(xu)列雜交結(jie)合，進而(er)(er)使用RNase H可特(te)異(yi)性降(jiang)解(jie)DNA/RNA雜合鏈(lian)上(shang)的(de)(de)(de)(de)RNA鏈(lian)以及使用DNase I去(qu)除(chu)寡(gua)核苷(gan)酸(suan)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)，來(lai)達到去(qu)除(chu)細(xi)(xi)(xi)菌(jun)rRNA的(de)(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)(de)(圖(tu)1)。該(gai)方(fang)法主要(yao)針(zhen)(zhen)對rRNA，在(zai)微(wei)生物(wu)單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)測序(xu)(xu)技(ji)術中(zhong)(zhong)需要(yao)在(zai)胞(bao)(bao)內進行(xing)rRNA的(de)(de)(de)(de)去(qu)除(chu)，而(er)(er)在(zai)對微(wei)生物(wu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)懸液(ye)進行(xing)微(wei)流(liu)控上(shang)機前(qian)應該(gai)盡(jin)量減少實驗操作步驟，減少對微(wei)生物(wu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)樣品的(de)(de)(de)(de)影響(xiang)。其(qi)次該(gai)方(fang)法非常依賴細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)透(tou)化(hua)(hua)效(xiao)果(guo)的(de)(de)(de)(de)好壞(huai)，透(tou)化(hua)(hua)效(xiao)果(guo)直接(jie)關系(xi)到寡(gua)核苷(gan)酸(suan)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)與(yu)rRNA序(xu)(xu)列的(de)(de)(de)(de)結(jie)合程度，間(jian)接(jie)決(jue)定rRNA的(de)(de)(de)(de)去(qu)除(chu)效(xiao)果(guo)，因此(ci)實驗數據存在(zai)不確定性。
圖1 使(shi)用特定探針進(jin)行RNase H介導的rRNA去除
基于CRISPR-Cas9的rRNA去除方法
天然(ran)(ran)的(de)(de)CRISPR-Cas系統(tong)在細(xi)(xi)菌(jun)適應性免(mian)疫中(zhong)(zhong)發揮作用(yong)(yong)，可(ke)在不(bu)損害細(xi)(xi)菌(jun)基因(yin)組的(de)(de)情況下去(qu)除(chu)侵(qin)入的(de)(de)噬菌(jun)體DNA。該機制(zhi)涉及Cas核酸(suan)酶(mei)(mei)對外(wai)源DNA的(de)(de)特(te)異性切割。該系統(tong)可(ke)以通過提(ti)供特(te)定的(de)(de)靶向rRNA序列(lie)(lie)(lie)或(huo)其(qi)他豐富序列(lie)(lie)(lie)的(de)(de)引(yin)導(dao)RNA一(yi)(yi)起(qi)使用(yong)(yong)，在文(wen)(wen)庫(ku)(ku)(ku)制(zhi)備完成后(hou)可(ke)以對rRNA或(huo)其(qi)他高豐度轉錄(lu)本的(de)(de)文(wen)(wen)庫(ku)(ku)(ku)片段(duan)進(jin)(jin)行(xing)降解(jie)。在微生物單細(xi)(xi)胞測序技(ji)術中(zhong)(zhong)，將(jiang)(jiang)準備好的(de)(de)測序文(wen)(wen)庫(ku)(ku)(ku)與Cas9核酸(suan)酶(mei)(mei)一(yi)(yi)起(qi)孵育(yu)，該核酸(suan)酶(mei)(mei)已與特(te)定的(de)(de)引(yin)導(dao)rRNA預復(fu)合。然(ran)(ran)后(hou)在文(wen)(wen)庫(ku)(ku)(ku)中(zhong)(zhong)切割包(bao)含任何目標序列(lie)(lie)(lie)的(de)(de)所有文(wen)(wen)庫(ku)(ku)(ku)片段(duan)。孵育(yu)之后(hou)是進(jin)(jin)行(xing)磁(ci)珠純(chun)化，以去(qu)除(chu)短(duan)的(de)(de)文(wen)(wen)庫(ku)(ku)(ku)片段(duan)和被切割的(de)(de)文(wen)(wen)庫(ku)(ku)(ku)片段(duan)。由于此步驟去(qu)除(chu)了大部分文(wen)(wen)庫(ku)(ku)(ku)片段(duan)，剩(sheng)余的(de)(de)文(wen)(wen)庫(ku)(ku)(ku)片段(duan)將(jiang)(jiang)通過另一(yi)(yi)輪PCR重新擴(kuo)增(zeng)(圖2)。該方法(fa)很(hen)適合在文(wen)(wen)庫(ku)(ku)(ku)制(zhi)備前不(bu)宜進(jin)(jin)行(xing)rRNA去(qu)除(chu)的(de)(de)樣品，但是其(qi)引(yin)導(dao)RNA設計相當復(fu)雜，需(xu)要很(hen)強的(de)(de)專(zhuan)業背景，此外(wai)測序文(wen)(wen)庫(ku)(ku)(ku)需(xu)要進(jin)(jin)行(xing)兩輪PCR擴(kuo)增(zeng)，可(ke)能會增(zeng)大序列(lie)(lie)(lie)擴(kuo)增(zeng)的(de)(de)偏(pian)倚(yi)。
圖2 CRISPR-Cas9指導(dao)文庫(ku)制備后rRNA的(de)去除(chu)
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以上(shang)就是(shi)目前在微(wei)生(sheng)物單細(xi)胞(bao)測序(xu)領域出現的(de)rRNA的(de)去(qu)除方法。目前本公司推出的(de)新產(chan)品smRNAPSN-seq采用的(de)rRNA去(qu)除方法，經多種(zhong)微(wei)生(sheng)物細(xi)胞(bao)樣品測試，rRNA占比最低可達5.82%，后期(qi)我們會進一步優化rRNA去(qu)除方法，加(jia)強數(shu)據(ju)穩(wen)定性，進一步降低rRNA占比(圖3)。
圖(tu)3 smRNAPSN-seq的(de)rRNA占比
