2024-01-18
單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)測(ce)序的(de)發展通過(guo)研究細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)間基因(yin)表(biao)達異(yi)質(zhi)性，徹底改(gai)變了轉(zhuan)錄組(zu)(zu)學的(de)研究。雖然這些技術已應用于(yu)(yu)各種(zhong)真核(he)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)種(zhong)，并揭示了有關細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)異(yi)質(zhi)性的(de)大(da)量(liang)信(xin)息(xi)，但(dan)它們(men)在(zai)原(yuan)核(he)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)中的(de)應用仍處于(yu)(yu)起步階段。與真核(he)單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉(zhuan)錄組(zu)(zu)測(ce)序相(xiang)比，由于(yu)(yu)原(yuan)核(he)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)內在(zai)轉(zhuan)錄本(轉(zhuan)錄本不穩定，拷貝(bei)數低，mRNA缺(que)乏poly-A尾)和(he)外在(zai)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)結構(具有厚且復雜(za)的(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)壁和(he)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)膜(mo)，體積(ji)小)的(de)特征，在(zai)原(yuan)核(he)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)中建立類似的(de)實(shi)驗流程面臨一些挑戰，因(yin)此建立多套(tao)質(zhi)控體系(固定后RNA質(zhi)檢(jian)、死活率質(zhi)檢(jian)和(he)透化效果質(zhi)檢(jian)等)克(ke)服實(shi)驗挑戰，以適應多樣(yang)化的(de)科(ke)研和(he)臨床工作的(de)開(kai)展。開(kai)展微(wei)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉(zhuan)錄組(zu)(zu)研究時，需要制備單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)懸液進行實(shi)驗。實(shi)驗樣(yang)品質(zhi)量(liang)是微(wei)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉(zhuan)錄組(zu)(zu)測(ce)序實(shi)驗的(de)關鍵(jian)因(yin)素之一，因(yin)此針對微(wei)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)樣(yang)品的(de)制備，保存(cun)與運輸的(de)要求進行了整理，趕緊來看(kan)一下吧！
單(dan)細胞轉(zhuan)錄組(zu)測序(xu)(xu)與常(chang)規轉(zhuan)錄組(zu)測序(xu)(xu)的區(qu)別-Advances in Applied Microbiology,2023,Ju
01、實(shi)驗(yan)樣品(pin)制備與(yu)運輸的一般流程
(1)提前與派(pai)森諾生物項目主管(guan)聯系，咨詢詳(xiang)細的實驗(yan)樣本要(yao)求(qiu)，實驗(yan)樣本需(xu)要(yao)具有(you)高(gao)質量轉錄組(zu)圖譜(pu)或轉錄組(zu)數據(ju)庫，同時具有(you)非傳染性(xing)(xing)和非致病性(xing)(xing)等特點(dian)才可接收，滿足要(yao)求(qiu)后填寫并提交樣本信息單；
(2)在(zai)對實驗樣(yang)品進行(xing)(xing)接種培養時，需要在(zai)生(sheng)物安全(quan)柜或(huo)(huo)超凈工(gong)(gong)作(zuo)(zuo)臺上進行(xing)(xing)接種培養，實驗中(zhong)使用(yong)的(de)培養基(ji)、培養瓶(ping)以及耗材等(deng)都是無(wu)菌的(de)，從而避免或(huo)(huo)減少外(wai)(wai)部污(wu)染或(huo)(huo)外(wai)(wai)部信號干擾，此外(wai)(wai)在(zai)對實驗樣(yang)品進行(xing)(xing)特(te)殊處理(li)時也要在(zai)生(sheng)物安全(quan)柜或(huo)(huo)超凈工(gong)(gong)作(zuo)(zuo)臺處理(li)，盡量避免操(cao)作(zuo)(zuo)污(wu)染。后續實驗如未進行(xing)(xing)特(te)殊標(biao)注，統一在(zai)生(sheng)物安全(quan)柜或(huo)(huo)超凈工(gong)(gong)作(zuo)(zuo)臺進行(xing)(xing)實驗操(cao)作(zuo)(zuo)；
(3)對(dui)于常(chang)規的(de)細(xi)菌培養(yang)樣(yang)品，優先(xian)取位(wei)于生(sheng)長曲線指數期(OD600=0.3-0.5)的(de)甲(jia)醛(quan)(quan)固(gu)定樣(yang)品進行(xing)送樣(yang)(實驗操作可參考附錄)，需寄送2管1ml新鮮冷的(de)0.1M Tris-Hcl-RI重懸的(de)細(xi)胞樣(yang)品；如未經過甲(jia)醛(quan)(quan)固(gu)定，則需要提供(gong)2管(20ml)培養(yang)好的(de)菌液或劃線平(ping)板(ban)，附帶(dai)液體(ti)或固(gu)體(ti)培養(yang)基以及培養(yang)條件(jian)；
不同生長時期的微生物細胞rRNA占比(bi)-mBio,2023,Homberger C et al.
(4)對(dui)于(yu)特(te)殊處(chu)理(li)(li)的(de)(de)細菌培養樣(yang)品，需老師自行進(jin)行相關(guan)的(de)(de)特(te)殊處(chu)理(li)(li)操(cao)作，為鎖定特(te)殊處(chu)理(li)(li)后(hou)的(de)(de)實驗樣(yang)品的(de)(de)初始轉錄本(ben)狀態，可進(jin)行甲醛固定(實驗操(cao)作可參(can)考(kao)附錄)，需寄送2管(guan)1ml新(xin)鮮(xian)冷的(de)(de)0.1M Tris-Hcl-RI重懸的(de)(de)細胞樣(yang)品。另外特(te)殊處(chu)理(li)(li)操(cao)作信息(xi)可填寫(xie)在樣(yang)品信息(xi)單(dan)的(de)(de)備注一欄中(zhong)；
(5)建議自測樣本的狀態(核酸完整度/是否存在污(wu)染等(deng))或(huo)干冰郵寄樣本由(you)本公(gong)司(si)質檢；
(6)使用封口膜將(jiang)存(cun)放甲醛(quan)固定樣品或培養好的(de)菌液的(de)離(li)心管以(yi)及及劃線(xian)平(ping)板封閉好，采用適當(dang)的(de)運(yun)輸條件進行運(yun)輸(運(yun)輸條件見下(xia)文“樣本(ben)儲存(cun)與(yu)運(yun)輸原(yuan)則”)；
(7)實驗室接收樣(yang)本，測定運輸盒內(nei)溫度及樣(yang)本狀態，拍照記錄并登(deng)記相關信(xin)息；
(8)組織相關的實驗(yan)(yan)樣本質控實驗(yan)(yan)。
02、實驗樣本制(zhi)備注意事項
微生(sheng)物細胞(bao)樣本制備需(xu)要保證細胞(bao)內的mRNA未降(jiang)解(jie)流失，鎖定轉錄本狀態，具(ju)體可參(can)考以(yi)下幾點建議：
(1)防止(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)樣(yang)品(pin)(pin)結(jie)團：取出位于生長曲線指數期(qi)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)樣(yang)品(pin)(pin)后立即(ji)進行(xing)低溫離心，去除液體培養基、雜質和細(xi)(xi)胞(bao)(bao)碎(sui)片(pian)后立即(ji)使用(yong)新(xin)鮮冷的(de)4%甲醛進行(xing)重懸(xuan)，吹打(da)混勻至無肉眼可見(jian)的(de)沉淀(dian)，將攜帶(dai)有甲醛重懸(xuan)微(wei)生物細(xi)(xi)胞(bao)(bao)樣(yang)品(pin)(pin)的(de)四維(wei)旋轉(zhuan)混勻儀(yi)置于4℃冰箱內(nei)進行(xing)震蕩過(guo)夜固(gu)定(ding)；
4℃冰箱內(nei)甲醛重懸細胞懸液震(zhen)蕩(dang)過(guo)夜固定
(2)防(fang)止(zhi)細胞(bao)樣品RNA降(jiang)解：微(wei)生物單(dan)細胞(bao)測(ce)序樣品制備操(cao)作(zuo)(zuo)全程需要在4℃下進行操(cao)作(zuo)(zuo)，另外(wai)細胞(bao)的重懸溶液中也要加入RNase抑制劑，防(fang)止(zhi)細胞(bao)樣品RNA降(jiang)解；
(3)保存(cun)與運(yun)(yun)(yun)輸溫(wen)度(du)：微生物單(dan)細(xi)(xi)胞測序的(de)不同類型的(de)細(xi)(xi)胞樣品需要遵(zun)照合適的(de)保存(cun)和(he)運(yun)(yun)(yun)輸溫(wen)度(du)進(jin)行郵寄(ji)，溫(wen)度(du)過(guo)高或(huo)導致細(xi)(xi)胞樣品RNA降解，溫(wen)度(du)過(guo)低會給細(xi)(xi)胞結構帶來破壞。樣本接收時，實驗(yan)室需要對運(yun)(yun)(yun)輸盒進(jin)行溫(wen)度(du)測量(liang)并記錄，不合格樣本將反饋異常(chang)，停止實驗(yan)。
03、樣本儲存(cun)與運輸原則
1、樣(yang)本(ben)儲存
甲(jia)(jia)醛(quan)固(gu)定(ding)樣(yang)(yang)(yang)本和常(chang)規(gui)菌液樣(yang)(yang)(yang)本(含液體培養基)均采用(yong)冰袋(dai)郵寄(ji)(ji)，劃線(xian)平板常(chang)溫寄(ji)(ji)送即可(ke)，甲(jia)(jia)醛(quan)固(gu)定(ding)樣(yang)(yang)(yang)本從樣(yang)(yang)(yang)本制備到實(shi)驗前(qian)應不超過48h，常(chang)規(gui)菌液或劃線(xian)平板從樣(yang)(yang)(yang)本制備到實(shi)驗前(qian)應不超過120h。
2、樣本運輸原則
① 填寫樣本(ben)信息單，發送郵(you)件并打印紙質(zhi)版；
② 細胞樣本(ben)保存離心管或塑(su)料平板應使(shi)用油性(xing)記(ji)號筆填寫樣本(ben)編號、日期(圖(tu)A)；
③ 將樣(yang)本(ben)置于離(li)心(xin)管，用封口(kou)膜封閉管口(kou)，裝入自封袋中(圖B)；
④ 樣本外部用緩(huan)沖(chong)膜包裹，防止直(zhi)接接觸冰(bing)袋(dai)引(yin)發結冰(bing)(圖C)；
⑤ 選擇厚(hou)度(du)不低于3cm的(de)泡(pao)沫(mo)盒，底部先(xian)放(fang)入一部分冰(bing)袋(圖D)；
⑥ 放入樣(yang)本與打印的樣(yang)本信息單(圖E)；
⑦ 根據寄送距(ju)離與時間，選擇合適(shi)大小的泡沫盒與不少于4塊冰袋，密封運輸；
備注：需提(ti)前(qian)準(zhun)備好冰袋(dai)，避免(mian)冰袋(dai)從(cong)-80℃或-20℃冰箱(xiang)拿出直接使用，否(fou)則會由于溫度過低導致樣本結(jie)冰，破壞細胞結(jie)構；運輸時間大(da)于24h，應不(bu)少于6塊(kuai)冰袋(dai)。
⑧選擇盡(jin)可能快的運輸方式，樣本(ben)寄送后，告知公司實驗(yan)室(shi)精(jing)確的寄送時間及(ji)快遞信息，以備(bei)實驗(yan)室(shi)提(ti)前準備(bei)相關的實驗(yan)樣本(ben)質控(kong)實驗(yan)。
實驗樣(yang)本包裝實例
以(yi)上(shang)就是(shi)有關微生物單(dan)(dan)細胞測(ce)序樣(yang)品的(de)(de)制備、儲存與(yu)運輸要(yao)求(qiu)，為保證實驗的(de)(de)順(shun)利進行，希(xi)望(wang)各位(wei)老師(shi)按照以(yi)上(shang)要(yao)求(qiu)進行操作。感謝您(nin)閱讀我們(men)的(de)(de)微生物單(dan)(dan)細胞測(ce)序送樣(yang)指南！如果您(nin)對微生物研(yan)(yan)究(jiu)感興趣，想(xiang)要(yao)了(le)解更多關于單(dan)(dan)細胞測(ce)序的(de)(de)信息，或(huo)者(zhe)需(xu)要(yao)我們(men)的(de)(de)專業團(tuan)隊為您(nin)提(ti)供支(zhi)持(chi)和指導，請隨時聯系(xi)我們(men)。讓我們(men)攜手探索微生物世界的(de)(de)奧秘，為科學研(yan)(yan)究(jiu)貢獻一份力量！期待與(yu)您(nin)的(de)(de)合(he)作，謝謝！
附錄-細胞甲醛固定實驗流程(cheng)
(1)將(jiang)培養至對數生長期的(de)菌(jun)液樣品在(zai)4℃，5500×g條件(jian)下(xia)離心10min；
(2)棄上清，將底部(bu)細菌重懸在5ml新鮮的冷4%甲(jia)醛溶(rong)液(1×PBS溶(rong)解(jie))中，4℃震蕩過(guo)夜16h；
(3)次日，將細(xi)胞在(zai)4℃條件(jian)下以5500×g離(li)心10min。去除上清液，將細(xi)胞重(zhong)新懸浮(fu)在(zai)1ml新鮮的(de)冷PBS-RI(0.1U/ul)中(zhong)，并轉移到(dao)無酶(mei)1.5ml離(li)心管中(zhong)，在(zai)4℃，7000×g離(li)心10min，去除上清液，將細(xi)胞重(zhong)新懸浮(fu)在(zai)補充有0.1U/ul RNase抑制劑(終(zhong)濃度)的(de)1ml新鮮的(de)冷0.1M Tris-Hcl-RI(pH7.5)中(zhong)(每(mei)一重(zhong)懸細(xi)菌細(xi)胞操作，至少吹打(da)10次以上，無肉眼(yan)可見(jian)沉淀)。
(4)試劑配制(zhi)：
①10ml的(de)4%甲醛溶液：在15ml離心管中加入0.4ml的(de)甲醛溶液，用9.6ml的(de)1xPBS溶解；
②10ml的PBS-RI(0.1U/ul)溶液(ye)：在15ml離心(xin)管中加入1000U的RNase抑(yi)制(zhi)劑(ji)，補(bu)充(chong)1xPBS溶液(ye)至10ml；
③10ml的0.1M Tris-Hcl-RI（0.1U/ul）溶液：在(zai)15ml離心(xin)管中加入1000U的RNA酶抑制劑和1ml 1M Tris-Hcl pH8，補無(wu)酶水至10ml。
