2024-01-19
單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)測(ce)序(Single-cell sequencing)是在單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)分辨率(lv)下研(yan)(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)細(xi)(xi)胞(bao)異質(zhi)性及(ji)其(qi)在微環境(jing)中(zhong)(zhong)作用的技術(shu)，為基礎科學(xue)(xue)研(yan)(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)、藥物研(yan)(yan)(yan)發、腫瘤(liu)治療與(yu)未來的臨(lin)床疾病(bing)研(yan)(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)提(ti)供了強(qiang)有力的工具。我們發現近幾年單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)的研(yan)(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)不再局(ju)限于醫學(xue)(xue)研(yan)(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)領(ling)域(yu)，該項技術(shu)已逐(zhu)漸在農學(xue)(xue)動(dong)植(zhi)物研(yan)(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)中(zhong)(zhong)展開(kai)應用。其(qi)中(zhong)(zhong)農學(xue)(xue)動(dong)物主要在家畜(chu)配子發生、早期胚胎發育的分子機(ji)制、肌(ji)肉發育和營養代謝調控等領(ling)域(yu)被廣泛應用。在植(zhi)物科學(xue)(xue)領(ling)域(yu)，越來越多從(cong)事(shi)植(zhi)物研(yan)(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)的科研(yan)(yan)(yan)工作者(zhe)，選擇單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)技術(shu)進行組(zu)織細(xi)(xi)胞(bao)類型鑒定(ding)、細(xi)(xi)胞(bao)類型差異、細(xi)(xi)胞(bao)進化與(yu)起源等方面的研(yan)(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)。
接下來小派(pai)分享派(pai)森(sen)諾生物參(can)與合作發表的(de)(de)2篇農學領域項目文章的(de)(de)研究思路~
研究(jiu)背景 肌(ji)間(jian)刺 (IBs) 是一種礦化(hua)(hua)的(de)(de)針狀(zhuang)體，存在(zai)于許(xu)多魚(yu)類肌(ji)隔(ge)中，但(dan)不是所有的(de)(de)硬骨(gu)魚(yu)物種都有。IBs 通常(chang)又小又尖銳，因(yin)此限制了(le)魚(yu)的(de)(de)加工方式，如果它卡(ka)在(zai)消費者的(de)(de)喉嚨或嘴里，會(hui)造成(cheng)傷(shang)害或創傷(shang)，從而(er)影(ying)響魚(yu)對許(xu)多消費者的(de)(de)吸(xi)引力。硬骨(gu)魚(yu) IBs 的(de)(de)發育機制和分(fen)(fen)(fen)子基礎目前尚(shang)未完全了(le)解，仍有待研(yan)(yan)究(jiu)。已有研(yan)(yan)究(jiu)證明(ming)，IBs起源于肌(ji)間(jian)隔(ge)肌(ji)腱(jian)的(de)(de)膜內骨(gu)化(hua)(hua)。在(zai)哺乳動物中，肌(ji)腱(jian)祖細(xi)胞的(de)(de)成(cheng)骨(gu)分(fen)(fen)(fen)化(hua)(hua)能(neng)力已被確定(ding)，但(dan)硬骨(gu)魚(yu)從肌(ji)腱(jian)祖細(xi)胞到成(cheng)骨(gu)細(xi)胞分(fen)(fen)(fen)化(hua)(hua)的(de)(de)分(fen)(fen)(fen)化(hua)(hua)模式和分(fen)(fen)(fen)子機制尚(shang)不清楚。
研究(jiu)材料 本研究(jiu)取(qu) 60dpf 野生(sheng)型斑馬魚的尾肌(ji)進行單細胞轉錄(lu)組測序。
研究思路
研究結果 研(yan)究(jiu)通過scRNA-seq獲(huo)得了(le) 60dpf 野(ye)生(sheng)型(xing)(xing)斑(ban)馬魚 (包含典型(xing)(xing)IBs型(xing)(xing)) 尾(wei)部(bu)肌肉組織(zhi)共(gong)13075個(ge)(ge)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，鑒(jian)定了(le)18個(ge)(ge)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)群（圖 A）。研(yan)究(jiu)者使用(yong) monocle2對(dui)肌腱(jian)祖細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、成(cheng)(cheng)熟肌腱(jian)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、分(fen)(fen)(fen)(fen)化肌腱(jian)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)成(cheng)(cheng)骨細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)進行(xing)了(le)擬時序分(fen)(fen)(fen)(fen)析，研(yan)究(jiu)IBs相關成(cheng)(cheng)骨細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)起源，富集分(fen)(fen)(fen)(fen)析顯(xian)示多個(ge)(ge)成(cheng)(cheng)骨細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)簇基因 (id2a、thbs1b、nog3、nog2、 tgfb3) 在TGF-β/BMP信號通路中(zhong)富集。對(dui)不(bu)同(tong)分(fen)(fen)(fen)(fen)化軌跡的(de)(de)表達模式的(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)析確(que)定了(le)10個(ge)(ge)參與IBs形成(cheng)(cheng)的(de)(de)關鍵(jian)候選基因 (runx2a, runx2b, sost, bmp2a, scpp1, spp1, entpd5a, entpd5b, sox11b 和(he) ccn4b)（圖 B）。為了(le)進一步(bu)確(que) 定調控 IBs 形成(cheng)(cheng)的(de)(de)關鍵(jian)基因，利用(yong) CRISPR-Cas9 發(fa)現(xian)，runx2b-/- 突變體(ti)的(de)(de) runx2b 蛋白和(he) IBs 表型(xing)(xing)與野(ye)生(sheng)型(xing)(xing)有(you)顯(xian)著差(cha)異。顯(xian)微 CT 掃(sao)描和(he)骨組織(zhi)染色也顯(xian)示突變體(ti)中(zhong) IBs 完全(quan)消失(shi)（圖 C）。隨后，對(dui) 60dpf 的(de)(de) runx2b+/+ 和(he) runx2b-/- 斑(ban)馬魚的(de)(de)IBs組織(zhi)進行(xing)了(le)scRNA-seq，發(fa)現(xian)突變體(ti)中(zhong)，成(cheng)(cheng)骨細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)幾(ji)乎(hu)消失(shi)，肌腱(jian)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)亞群與總細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)數相比的(de)(de)百(bai)分(fen)(fen)(fen)(fen)比也出現(xian)了(le)不(bu)同(tong)程度的(de)(de)下降(jiang)。且runx2b+/+ 和(he) runx2b-/- 成(cheng)(cheng)骨細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)簇之間的(de)(de)差(cha)異表達基因在TGF-β/BMP通路中(zhong)顯(xian)著富集（圖 D）。進一步(bu)闡明了(le)runx2b對(dui)成(cheng)(cheng)骨細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)分(fen)(fen)(fen)(fen)化和(he)IBs形成(cheng)(cheng)的(de)(de)促(cu)進作(zuo)用(yong)。
研究背(bei)景(jing) 萜(tie)(tie)(tie)(tie)類化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)是一(yi)類多樣化(hua)(hua)(hua)的(de)(de)(de)代謝產物(wu)(wu)，自然(ran)存在的(de)(de)(de)萜(tie)(tie)(tie)(tie)類化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)超過(guo)50000種。植(zhi)物(wu)(wu)在應對不同環境時會(hui)合(he)(he)(he)成(cheng)(cheng)不同的(de)(de)(de)萜(tie)(tie)(tie)(tie)類化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)，一(yi)些特殊(shu)的(de)(de)(de)萜(tie)(tie)(tie)(tie)類化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)在傳粉、種子(zi)傳播和防御等過(guo)程中發揮重要的(de)(de)(de)作用，它(ta)們的(de)(de)(de)合(he)(he)(he)成(cheng)(cheng)發生在植(zhi)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)特定(ding)器官。腺體存在于棉(mian)花的(de)(de)(de)葉片、莖和種子(zi)中，負責積累各種非揮發性萜(tie)(tie)(tie)(tie)類化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)（例如棉(mian)酚(fen)），這些萜(tie)(tie)(tie)(tie)類化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)合(he)(he)(he)成(cheng)(cheng)源(yuan)于甲羥戊酸途(tu)徑（mevalonate (MVA) pathway）。為了抵御植(zhi)食性昆蟲的(de)(de)(de)侵襲，棉(mian)花葉片釋放復雜的(de)(de)(de)揮發性萜(tie)(tie)(tie)(tie)類。盡管(guan)一(yi)些研究已經報道了萜(tie)(tie)(tie)(tie)類化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)合(he)(he)(he)成(cheng)(cheng)酶和轉(zhuan)錄調控因子(zi)的(de)(de)(de)鑒定(ding)，然(ran)而(er)不同萜(tie)(tie)(tie)(tie)類化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)時空調控仍然(ran)缺乏(fa)清晰(xi)的(de)(de)(de)認識。
研究材料 發育15天的棉花真葉(xie)（水培），解離(li)原生(sheng)質體。
研究思(si)路
研(yan)究(jiu)結果 作 者 通(tong)(tong) 過(guo)(guo) scRNA-seq 獲 得 了 發 育 15 天(tian) 的(de)(de)(de) 棉 花 真 葉 組(zu) 織 22163 個(ge) 高 質 量 細(xi) 胞(bao)(bao)(bao)。通(tong)(tong) 過(guo)(guo) 聚 類(lei)(lei) 分(fen) 群 得 到 14 個(ge) clusters，通(tong)(tong)過(guo)(guo) marker 基因注釋和(he)原位雜交(jiao)驗(yan)證(zheng)鑒定(ding)到 6 種細(xi)胞(bao)(bao)(bao)類(lei)(lei)型：分(fen)別是葉肉細(xi)胞(bao)(bao)(bao)（MCs）、表皮(pi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)（ECs）、 保衛(wei)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)（GCs）、維(wei)管束細(xi)胞(bao)(bao)(bao)（VCs）、增殖細(xi)胞(bao)(bao)(bao)（PCs）和(he)分(fen)泌(mi)型腺(xian)體(ti)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)（SGCs）（圖(tu) A）。結果顯示(shi)：分(fen)泌(mi)型腺(xian)體(ti)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)特異表達(da)棉酚(fen)合(he)(he)成途(tu)徑、上(shang)游甲羥戊酸途(tu)徑（MVA）、揮(hui)發性(xing)單(dan)萜和(he)倍半萜合(he)(he)成的(de)(de)(de)萜類(lei)(lei)合(he)(he)酶等編(bian)碼(ma)基因（圖(tu) B、D）。結合(he)(he)結合(he)(he)單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)和(he)多組(zu)織轉(zhuan)錄(lu)組(zu)數據，精確鑒定(ding)到了兩個(ge)新的(de)(de)(de)、特異表達(da)在腺(xian)體(ti)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)中的(de)(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)因子GoHSFA4a和(he)GoNAC42（圖(tu) C）。進(jin)一(yi)步通(tong)(tong)過(guo)(guo)順(shun)式(shi)作用元件預測、雙熒(ying)光素(su)酶、EMSA 和(he)酵母單(dan)雜交(jiao)實(shi)驗(yan)表明GoHSFA4a 和(he) GoNAC42 通(tong)(tong)過(guo)(guo)激活特定(ding)的(de)(de)(de)棉酚(fen)合(he)(he)成和(he) MVA 途(tu)徑基因，從而調節棉酚(fen)型代謝(xie)物(wu)的(de)(de)(de)生物(wu)合(he)(he)成。
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