2021-01-25
在(zai)(zai)微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物研究領域(yu)，傳統(tong)(tong)的(de)(de)下一代測(ce)序(xu)技(ji)術已(yi)經取得了巨大的(de)(de)突破(po)，極大地促進了我們對人體(ti)微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物組(zu)的(de)(de)分類、功(gong)(gong)能(neng)及其(qi)宿主影響的(de)(de)理(li)解，但在(zai)(zai)揭示微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物群(qun)落(luo)復雜(za)性和功(gong)(gong)能(neng)多(duo)樣性方面仍存在(zai)(zai)一些限(xian)制。而微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物單細(xi)胞(bao)(bao)(bao)測(ce)序(xu)技(ji)術的(de)(de)問世，正為我們帶來了一種全(quan)新的(de)(de)解決(jue)方案。與傳統(tong)(tong)的(de)(de)NGS測(ce)序(xu)相比，微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物單細(xi)胞(bao)(bao)(bao)測(ce)序(xu)技(ji)術可以突破(po)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)混合效應，實現對微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物群(qun)落(luo)中(zhong)每個(ge)個(ge)體(ti)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)獨立(li)測(ce)序(xu)和分析，從單個(ge)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)層面了解微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物菌落(luo)的(de)(de)異質(zhi)性(不(bu)同(tong)(tong)形態特(te)征、生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)化特(te)性和基因表達譜等)、微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物群(qun)落(luo)中(zhong)不(bu)同(tong)(tong)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)功(gong)(gong)能(neng)、互作關系(xi)和遺傳變(bian)異。
上海派森諾(nuo)2023年(nian)正式發布了(le)微(wei)(wei)(wei)(wei)生(sheng)物單(dan)細胞(bao)轉錄(lu)組測(ce)(ce)序(xu)技(ji)(ji)術(shu)服(fu)務產(chan)品—smRNAPSN-seq，基于10X 微(wei)(wei)(wei)(wei)流控(kong)平臺的(de)(de)微(wei)(wei)(wei)(wei)生(sheng)物單(dan)細胞(bao)轉錄(lu)組測(ce)(ce)序(xu)技(ji)(ji)術(shu)，實(shi)現(xian)了(le)微(wei)(wei)(wei)(wei)生(sheng)物單(dan)細胞(bao)水平的(de)(de)轉錄(lu)組分析，它將(jiang)促進未(wei)來在鑒定新的(de)(de)細胞(bao)亞(ya)群、微(wei)(wei)(wei)(wei)生(sheng)物表(biao)型異質(zhi)性的(de)(de)分子(zi)機制(耐(nai)藥(yao)性、刺激(ji)環境(jing)適應性、代謝產(chan)物產(chan)量差異等)、微(wei)(wei)(wei)(wei)生(sheng)物演化及微(wei)(wei)(wei)(wei)生(sheng)物與宿主(zhu)相互作用等領域的(de)(de)研究。有關微(wei)(wei)(wei)(wei)生(sheng)物單(dan)細胞(bao)測(ce)(ce)序(xu)技(ji)(ji)術(shu)的(de)(de)整體實(shi)驗(yan)流程(cheng)、實(shi)驗(yan)質(zhi)控(kong)、rRNA去除以及送樣攻(gong)略前面(mian)已經介紹完了(le)，現(xian)在讓我們來介紹一下(xia)微(wei)(wei)(wei)(wei)生(sheng)物單(dan)細胞(bao)測(ce)(ce)序(xu)技(ji)(ji)術(shu)的(de)(de)數據分析流程(cheng)、實(shi)測(ce)(ce)數據結果以及主(zhu)要應用方向。
數據(ju)分析(xi)流程 微(wei)生物單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)測序技術(shu)主要(yao)的(de)(de)(de)分(fen)(fen)析(xi)流程(如圖1所示)。首先需要(yao)對(dui)微(wei)生物單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)文庫(ku)的(de)(de)(de)原(yuan)始(shi)下機(ji)數據(ju)進行(xing)基(ji)(ji)(ji)本分(fen)(fen)析(xi)，依次為數據(ju)質(zhi)(zhi)控、參考基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)比對(dui)、Barcode和(he)(he)UMI的(de)(de)(de)校正與(yu)計數以(yi)及根據(ju)Barcode和(he)(he)UMI的(de)(de)(de)統計結(jie)果生成Feature-Barcode表達矩(ju)陣(zhen)。然后(hou)根據(ju)單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)表達矩(ju)陣(zhen)和(he)(he)每個細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)表達譜特征去除低質(zhi)(zhi)量(liang)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)。使(shi)用相(xiang)關軟(ruan)件識別與(yu)解釋單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)原(yuan)始(shi)的(de)(de)(de)表達矩(ju)陣(zhen)中異質(zhi)(zhi)性(xing)的(de)(de)(de)來(lai)源(yuan)，該步驟(zou)主要(yao)包括細(xi)(xi)(xi)胞(bao)與(yu)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)質(zhi)(zhi)量(liang)控制，降維與(yu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)聚(ju)類，標記(ji)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)可(ke)視化與(yu)差(cha)異分(fen)(fen)析(xi)等(deng)。在完成標記(ji)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)鑒(jian)定和(he)(he)差(cha)異分(fen)(fen)析(xi)后(hou)對(dui)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)集進行(xing)通路分(fen)(fen)析(xi)(GO和(he)(he)KEGG)以(yi)及使(shi)用Monocle軟(ruan)件根據(ju)單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)表達的(de)(de)(de)相(xiang)似(si)性(xing)進行(xing)擬時序分(fen)(fen)析(xi)來(lai)說明細(xi)(xi)(xi)胞(bao)類群之間的(de)(de)(de)關系。 圖1 smRNAPSN-seq數據分析流(liu)程
實測數據結果 為驗(yan)(yan)證(zheng)smRNAPSN-seq實(shi)驗(yan)(yan)技術和數(shu)據分(fen)析(xi)(xi)流程(cheng)的(de)可(ke)行(xing)性，我們進(jin)行(xing)了內測實(shi)驗(yan)(yan)，部(bu)分(fen)數(shu)據分(fen)析(xi)(xi)結果(guo)如圖2所示(shi)，UMAP分(fen)析(xi)(xi)顯(xian)示(shi)出17個(ge)(ge)細胞亞(ya)群，其次(ci)每(mei)(mei)個(ge)(ge)亞(ya)群間(jian)(jian)的(de)高表(biao)達基因(yin)和基因(yin)表(biao)達量(liang)也出現明顯(xian)差異(圖2a、b、c)。同時確定每(mei)(mei)個(ge)(ge)亞(ya)群的(de)差異表(biao)達基因(yin)并進(jin)行(xing)了熱圖分(fen)析(xi)(xi)(圖2d)。此外(wai)，樣本間(jian)(jian)的(de)數(shu)據分(fen)析(xi)(xi)顯(xian)示(shi)：空白組(zu)與處理組(zu)的(de)細胞亞(ya)群比(bi)例和部(bu)分(fen)功能基因(yin)表(biao)達量(liang)存在顯(xian)著差異(圖2e、f)。以上結果(guo)表(biao)明細菌在處理的(de)條件下會出現異質(zhi)性，而傳統(tong)的(de)轉錄組(zu)測序會掩蓋這(zhe)種(zhong)異質(zhi)性的(de)存在，而smRNAPSN-seq可(ke)以發現并區分(fen)這(zhe)種(zhong)異質(zhi)性。 圖2 smRNAPSN-seq實測數據(ju)結(jie)果展示
主要應(ying)用方向 本公司(si)采用smRNAPSN-seq實(shi)驗(yan)方法分(fen)析了(le)在(zai)實(shi)驗(yan)處理條件下(xia)微(wei)生(sheng)物菌(jun)(jun)(jun)群(qun)的(de)(de)異質性，大(da)大(da)增加了(le)發現稀有(you)罕見細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)亞(ya)群(qun)的(de)(de)概率，同時(shi)可以根據細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)亞(ya)群(qun)間的(de)(de)差(cha)異和高表(biao)(biao)(biao)達(da)基(ji)因進行(xing)(xing)基(ji)因選(xuan)擇(ze)敲除，以此在(zai)單(dan)個細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)層(ceng)(ceng)次來探(tan)究細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)代謝調控等通路的(de)(de)分(fen)子機(ji)制(zhi)。此外微(wei)生(sheng)物單(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)轉錄組測(ce)序還可應用于(yu)以下(xia)研究：(1)抗生(sheng)素耐藥分(fen)析：無需(xu)進行(xing)(xing)分(fen)離(li)培養，從(cong)單(dan)個細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)層(ceng)(ceng)次的(de)(de)基(ji)因表(biao)(biao)(biao)達(da)情況研究細(xi)(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)耐藥機(ji)制(zhi)；(2)微(wei)生(sheng)物時(shi)序表(biao)(biao)(biao)達(da)分(fen)析：鑒定(ding)(ding)(ding)外在(zai)特殊狀態的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)并確定(ding)(ding)(ding)它(ta)們(men)分(fen)化(hua)發育過(guo)程(cheng)，結合基(ji)因表(biao)(biao)(biao)達(da)變(bian)化(hua)，實(shi)現單(dan)個細(xi)(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)內表(biao)(biao)(biao)達(da)量的(de)(de)檢測(ce)來解析微(wei)生(sheng)物時(shi)序表(biao)(biao)(biao)達(da)；(3)微(wei)生(sheng)物群(qun)落功能定(ding)(ding)(ding)位分(fen)析：可以在(zai)研究單(dan)個細(xi)(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)基(ji)因表(biao)(biao)(biao)達(da)的(de)(de)基(ji)礎(chu)上，將每個細(xi)(xi)(xi)菌(jun)(jun)(jun)(物種)與其基(ji)因表(biao)(biao)(biao)達(da)信息相關聯，有(you)助于(yu)了(le)解微(wei)生(sheng)物群(qun)落內的(de)(de)異質性，生(sheng)態進化(hua)壓力和進化(hua)過(guo)程(cheng)等，如(ru)圖3所示。 圖3 微生物單細胞轉錄組(zu)測序的(de)應(ying)用方向 在(zai)微(wei)生物(wu)學研(yan)(yan)究領域，微(wei)生物(wu)單(dan)細胞測序技術(shu)的(de)(de)(de)應用已經成為(wei)(wei)(wei)了不(bu)可(ke)或缺的(de)(de)(de)工具(ju)。然而，這(zhe)項技術(shu)對(dui)數(shu)據處理和(he)(he)分(fen)(fen)析能(neng)力的(de)(de)(de)要求也(ye)在(zai)不(bu)斷提(ti)高著。作為(wei)(wei)(wei)一(yi)家國內知名的(de)(de)(de)科技服務公司，我們一(yi)直致力于開發最(zui)先進的(de)(de)(de)工具(ju)和(he)(he)流(liu)(liu)程，以(yi)幫助研(yan)(yan)究人員更好地理解(jie)微(wei)生物(wu)世界的(de)(de)(de)復雜性(xing)(xing)和(he)(he)多(duo)樣(yang)性(xing)(xing)。我們的(de)(de)(de)微(wei)生物(wu)單(dan)細胞測序數(shu)據分(fen)(fen)析流(liu)(liu)程，不(bu)僅可(ke)以(yi)提(ti)供高效、準確(que)的(de)(de)(de)數(shu)據處理和(he)(he)分(fen)(fen)析結果，還可(ke)以(yi)為(wei)(wei)(wei)您提(ti)供個性(xing)(xing)化的(de)(de)(de)解(jie)讀和(he)(he)建議，幫助您深入(ru)探索微(wei)生物(wu)群落中的(de)(de)(de)生物(wu)學信(xin)息。感謝您的(de)(de)(de)耐心閱讀，我們期待為(wei)(wei)(wei)您的(de)(de)(de)研(yan)(yan)究提(ti)供更優質、更全(quan)面的(de)(de)(de)支(zhi)持。
