隨著單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)測(ce)序(xu)技(ji)術(shu)的(de)(de)(de)快速發展(zhan)，單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)測(ce)序(xu)的(de)(de)(de)應用(yong)范(fan)圍(wei)也越來越廣泛(fan)，從動物(wu)(wu)、植(zhi)物(wu)(wu)逐(zhu)漸觸及微(wei)生物(wu)(wu)領(ling)域(yu)。在微(wei)生物(wu)(wu)領(ling)域(yu)中，尤其是原核(he)生物(wu)(wu)，細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)體積小，存(cun)在細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)壁、轉錄(lu)(lu)本不(bu)穩定(ding)，拷(kao)貝數(shu)低，mRNA缺(que)乏polyA尾等特征嚴重阻礙了微(wei)生物(wu)(wu)單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)測(ce)序(xu)的(de)(de)(de)應用(yong)，該(gai)技(ji)術(shu)目前仍處于(yu)起步階段。為促(cu)進微(wei)生物(wu)(wu)領(ling)域(yu)的(de)(de)(de)快速發展(zhan)，本公(gong)司推出一(yi)款單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)測(ce)序(xu)新產品：smRNAPSN-seq，該(gai)產品為科研人(ren)員(yuan)提(ti)供了一(yi)種(zhong)高通量(liang)的(de)(de)(de)微(wei)生物(wu)(wu)單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉錄(lu)(lu)組分(fen)析工具，它將促(cu)進未來在鑒定(ding)新的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)亞群、微(wei)生物(wu)(wu)表型異質(zhi)性的(de)(de)(de)分(fen)子(zi)機制(耐藥性、刺激環境適應性、代謝產物(wu)(wu)產量(liang)差(cha)異等)、微(wei)生物(wu)(wu)演化及微(wei)生物(wu)(wu)與宿(su)主相互作用(yong)等領(ling)域(yu)的(de)(de)(de)研究，接(jie)下來我將從以下7個方面進行介紹：

首先需(xu)要使(shi)用(yong)甲(jia)醛溶液(ye)(ye)對(dui)培養至對(dui)數生(sheng)(sheng)長(chang)期的(de)(de)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)細(xi)(xi)(xi)胞進(jin)行(xing)固定(ding)，交聯胞內的(de)(de)核酸和(he)蛋白質，以防止(zhi)mRNA降(jiang)解；接著(zhu)對(dui)固定(ding)后(hou)(hou)(hou)的(de)(de)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)細(xi)(xi)(xi)胞進(jin)行(xing)透化，以便(bian)進(jin)行(xing)rRNA的(de)(de)去(qu)除；然后(hou)(hou)(hou)通過細(xi)(xi)(xi)菌(jun)計數板確(que)定(ding)處(chu)理后(hou)(hou)(hou)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞懸液(ye)(ye)濃(nong)度并稀釋(shi)至合適濃(nong)度。使(shi)用(yong)10X平臺將單個微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)細(xi)(xi)(xi)胞與膠珠等組分封裝(zhuang)到液(ye)(ye)滴中并進(jin)行(xing)RT反(fan)應(ying)，給每個cDNA上添加分子標簽。破油后(hou)(hou)(hou)對(dui)標記(ji)cDNA進(jin)行(xing)擴(kuo)增，最后(hou)(hou)(hou)進(jin)行(xing)文庫構建，上機測序，如圖1所示。

圖1基(ji)于10X平臺的smRNAPSN-seq的技術路線(xian)及實驗流(liu)程

因微(wei)生(sheng)(sheng)物樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)的(de)(de)(de)(de)(de)特(te)殊(shu)性，大部(bu)分實驗操(cao)(cao)作需(xu)要(yao)在(zai)生(sheng)(sheng)物安全柜或超凈工(gong)作臺上(shang)進(jin)行，實驗中(zhong)使用的(de)(de)(de)(de)(de)培(pei)養(yang)基、培(pei)養(yang)瓶以及耗材等都是(shi)無菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)(de)(de)(de)，從(cong)而避(bi)免或減少外(wai)(wai)部(bu)污染(ran)或外(wai)(wai)部(bu)信(xin)(xin)號干擾。對于常規的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)菌(jun)(jun)(jun)培(pei)養(yang)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)，優先取位于生(sheng)(sheng)長曲線(xian)指數(shu)期(OD600=0.3-0.5)的(de)(de)(de)(de)(de)甲醛固(gu)(gu)(gu)定(ding)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)進(jin)行送樣(yang)(yang)(yang)(yang)(實驗操(cao)(cao)作可(ke)(ke)參考附錄)，需(xu)寄(ji)送2管(guan)1ml新(xin)鮮(xian)冷的(de)(de)(de)(de)(de)0.1M Tris-Hcl-RI重懸(xuan)的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)；如未經過(guo)甲醛固(gu)(gu)(gu)定(ding)，則需(xu)要(yao)提供2管(guan)(20ml)培(pei)養(yang)好(hao)的(de)(de)(de)(de)(de)菌(jun)(jun)(jun)液(ye)或劃線(xian)平(ping)板(ban)，附帶液(ye)體(ti)或固(gu)(gu)(gu)體(ti)培(pei)養(yang)基以及培(pei)養(yang)條件；對于特(te)殊(shu)處(chu)理(li)的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)菌(jun)(jun)(jun)培(pei)養(yang)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)，需(xu)老師自行進(jin)行相關(guan)的(de)(de)(de)(de)(de)特(te)殊(shu)處(chu)理(li)操(cao)(cao)作，為鎖定(ding)特(te)殊(shu)處(chu)理(li)后的(de)(de)(de)(de)(de)實驗樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)的(de)(de)(de)(de)(de)轉錄本(ben)狀態，可(ke)(ke)進(jin)行甲醛固(gu)(gu)(gu)定(ding)(實驗操(cao)(cao)作可(ke)(ke)參考附錄)，需(xu)寄(ji)送2管(guan)1ml新(xin)鮮(xian)的(de)(de)(de)(de)(de)冷的(de)(de)(de)(de)(de)0.1M Tris-Hcl-RI重懸(xuan)的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)。另外(wai)(wai)特(te)殊(shu)處(chu)理(li)操(cao)(cao)作信(xin)(xin)息可(ke)(ke)填(tian)寫在(zai)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)信(xin)(xin)息單的(de)(de)(de)(de)(de)備注一(yi)欄中(zhong)；之(zhi)后使用封(feng)口膜(mo)將存(cun)放甲醛固(gu)(gu)(gu)定(ding)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)或培(pei)養(yang)好(hao)的(de)(de)(de)(de)(de)菌(jun)(jun)(jun)液(ye)的(de)(de)(de)(de)(de)離心(xin)管(guan)以及劃線(xian)平(ping)板(ban)封(feng)閉好(hao)，放入(ru)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)袋中(zhong)封(feng)裝，在(zai)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)袋外(wai)(wai)包裹(guo)有(you)緩沖膜(mo)，防止樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)直(zhi)接接觸冰袋出(chu)現結(jie)冰現象，然后將樣(yang)(yang)(yang)(yang)本(ben)信(xin)(xin)息單與微(wei)生(sheng)(sheng)物細(xi)胞(bao)(bao)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)一(yi)起打(da)包郵寄(ji)，如圖2所(suo)示。詳細(xi)介紹(shao)可(ke)(ke)見(jian)：。

圖2 樣品制備(bei)及(ji)包裝流程

實驗操作是否規范在(zai)很大程度上決定(ding)(ding)了測(ce)序數(shu)(shu)(shu)據(ju)的(de)質(zhi)量(liang)，微(wei)生(sheng)物(wu)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉錄組測(ce)序實驗操作中，單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)懸液(ye)的(de)制(zhi)備、細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)固定(ding)(ding)透(tou)(tou)化(hua)等(deng)環節都需要(yao)嚴格質(zhi)控，質(zhi)控合格才能保證數(shu)(shu)(shu)據(ju)結果(guo)(guo)的(de)質(zhi)量(liang)和穩定(ding)(ding)性。例(li)如樣(yang)品(pin)(pin)核(he)酸(suan)質(zhi)檢(jian)、細(xi)(xi)胞(bao)(bao)死活(huo)率(lv)(lv)質(zhi)檢(jian)和透(tou)(tou)化(hua)效(xiao)(xiao)果(guo)(guo)質(zhi)檢(jian)。寄送(song)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)樣(yang)品(pin)(pin)需要(yao)對其樣(yang)品(pin)(pin)狀態(tai)(死活(huo)率(lv)(lv)、RNA狀態(tai)等(deng))進行(xing)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)(ding)。首先從樣(yang)品(pin)(pin)中取出(chu)(chu)一部分(fen)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)懸液(ye)進行(xing)熒光(guang)染料染色(se)，在(zai)熒光(guang)顯微(wei)鏡下觀(guan)察，發(fa)(fa)出(chu)(chu)綠色(se)熒光(guang)的(de)為活(huo)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(圖(tu)3a)，發(fa)(fa)出(chu)(chu)紅色(se)熒光(guang)的(de)為死細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(圖(tu)3b)，使用軟(ruan)件工具將兩(liang)(liang)者合并(bing)在(zai)一起計算(suan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)活(huo)率(lv)(lv)(圖(tu)3c)。其次需要(yao)對微(wei)生(sheng)物(wu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)核(he)酸(suan)進行(xing)提取并(bing)檢(jian)測(ce)(圖(tu)4)，保證樣(yang)品(pin)(pin)核(he)酸(suan)具有較好的(de)完整(zheng)性(RIN > 8)。最(zui)后需要(yao)對樣(yang)品(pin)(pin)的(de)透(tou)(tou)化(hua)效(xiao)(xiao)果(guo)(guo)進行(xing)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)(ding)，因透(tou)(tou)化(hua)效(xiao)(xiao)果(guo)(guo)決定(ding)(ding)了樣(yang)品(pin)(pin)的(de)數(shu)(shu)(shu)據(ju)有效(xiao)(xiao)利用率(lv)(lv)。透(tou)(tou)化(hua)效(xiao)(xiao)果(guo)(guo)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)(ding)分(fen)為兩(liang)(liang)種：打孔透(tou)(tou)化(hua)效(xiao)(xiao)果(guo)(guo)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)(ding)(圖(tu)5a，b)和溶(rong)壁(bi)透(tou)(tou)化(hua)效(xiao)(xiao)果(guo)(guo)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)(ding)(圖(tu)5c，d，e，f)，熒光(guang)強度與透(tou)(tou)化(hua)效(xiao)(xiao)果(guo)(guo)成(cheng)正比(bi)。

圖3 微(wei)生物細胞死活率(lv)質檢圖

圖4 微生物細胞(bao)RNA 2100質檢(jian)圖

圖5 樣品透化效果鏡檢(jian)圖

細(xi)(xi)菌(jun)核(he)糖(tang)體核(he)糖(tang)核(he)酸(suan)(rRNA)是存在(zai)于(yu)細(xi)(xi)菌(jun)細(xi)(xi)胞中的(de)一(yi)類RNA分子，約占(zhan)(zhan)總(zong)RNA 80% - 98%，rRNA在(zai)蛋白質合成過程(cheng)中起到關(guan)鍵作用，但是在(zai)研究遺傳調控(kong)機制或NGS測(ce)序技術等方(fang)(fang)(fang)面，還是要(yao)看信使(shi)核(he)糖(tang)核(he)酸(suan)(mRNA)。而(er)在(zai)微(wei)生(sheng)物單(dan)細(xi)(xi)胞轉錄組(zu)測(ce)序中，由于(yu)原核(he)生(sheng)物mRNA缺(que)乏(fa)PolyA尾，無(wu)法(fa)效仿真核(he)生(sheng)物進行(xing)mRNA的(de)捕(bu)獲，從而(er)選擇(ze)進行(xing)rRNA的(de)消減。目前應(ying)用于(yu)微(wei)生(sheng)物單(dan)細(xi)(xi)胞轉錄組(zu)測(ce)序的(de)rRNA去(qu)(qu)除(chu)(chu)方(fang)(fang)(fang)法(fa)主要(yao)有(you)：基于(yu)CRISPR-Cas9的(de)rRNA去(qu)(qu)除(chu)(chu)方(fang)(fang)(fang)法(fa)(圖(tu)(tu)6a)，基于(yu)酶法(fa)的(de)RNase H介(jie)導的(de)rRNA去(qu)(qu)除(chu)(chu)方(fang)(fang)(fang)法(fa)(圖(tu)(tu)6b)。兩種方(fang)(fang)(fang)法(fa)各有(you)優(you)劣(表1)。目前本公司推出的(de)新產(chan)品(pin)smRNAPSN-seq采用的(de)rRNA去(qu)(qu)除(chu)(chu)方(fang)(fang)(fang)法(fa)，經多(duo)種微(wei)生(sheng)物細(xi)(xi)胞樣品(pin)測(ce)試，rRNA占(zhan)(zhan)比(bi)最(zui)低可達5.82%，后期(qi)我們會進一(yi)步優(you)化rRNA去(qu)(qu)除(chu)(chu)方(fang)(fang)(fang)法(fa)，加強數據穩(wen)定性(xing)，進一(yi)步降低rRNA占(zhan)(zhan)比(bi)(圖(tu)(tu)6c)。

圖6 微生物單細胞(bao)測(ce)序rRNA去除

表1 兩(liang)種去除rRNA方法的優缺點比(bi)較

微生物(wu)單(dan)細(xi)(xi)胞測(ce)序分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)流(liu)程如(ru)圖7所(suo)示(shi)，首先需要對(dui)獲得的(de)(de)原始數(shu)(shu)據(ju)(ju)進(jin)行(xing)數(shu)(shu)據(ju)(ju)質(zhi)控、基(ji)因(yin)(yin)組比對(dui)、10x Barcode和(he)(he)UMI統(tong)計及(ji)生成表達矩陣等基(ji)本分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)；之(zhi)后對(dui)過(guo)濾后的(de)(de)數(shu)(shu)據(ju)(ju)進(jin)行(xing)細(xi)(xi)胞聚(ju)類及(ji)可(ke)視化等初步(bu)分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)，在(zai)此基(ji)礎上(shang)(shang)可(ke)進(jin)行(xing)菌群鑒定(ding)、基(ji)因(yin)(yin)功能注釋及(ji)擬時序分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)等高(gao)(gao)級分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)。為驗證smRNAPSN-seq實驗技術和(he)(he)分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)流(liu)程的(de)(de)可(ke)行(xing)性(xing)，我們進(jin)行(xing)了內測(ce)實驗，部分(fen)(fen)(fen)數(shu)(shu)據(ju)(ju)分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)結(jie)果如(ru)圖8所(suo)示(shi)，UMAP分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)顯(xian)示(shi)出(chu)17個細(xi)(xi)胞亞(ya)(ya)群，其次每(mei)(mei)個亞(ya)(ya)群間(jian)的(de)(de)高(gao)(gao)表達基(ji)因(yin)(yin)和(he)(he)基(ji)因(yin)(yin)表達量(liang)(liang)也出(chu)現(xian)明(ming)顯(xian)差(cha)異(圖8a、b、c)。同時確定(ding)每(mei)(mei)個亞(ya)(ya)群的(de)(de)差(cha)異表達基(ji)因(yin)(yin)并進(jin)行(xing)了熱(re)圖分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)(圖8d)。此外，樣本間(jian)的(de)(de)數(shu)(shu)據(ju)(ju)分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)顯(xian)示(shi)：空白組與處(chu)理組的(de)(de)細(xi)(xi)胞亞(ya)(ya)群比例和(he)(he)部分(fen)(fen)(fen)功能基(ji)因(yin)(yin)表達量(liang)(liang)存(cun)在(zai)顯(xian)著差(cha)異(圖8e、f)。以上(shang)(shang)結(jie)果表明(ming)細(xi)(xi)菌在(zai)處(chu)理的(de)(de)條件下會出(chu)現(xian)異質(zhi)性(xing)，而傳(chuan)統(tong)的(de)(de)轉錄(lu)組測(ce)序會掩蓋這(zhe)種異質(zhi)性(xing)的(de)(de)存(cun)在(zai)，而smRNAPSN-seq可(ke)以發現(xian)并區分(fen)(fen)(fen)這(zhe)種異質(zhi)性(xing)。

圖7 smRNAPSN-seq數據分析(xi)流(liu)程

圖8 smRNAPSN-seq實測數(shu)據結果展示

smRNAPSN-seq是本公(gong)司(si)自主(zhu)研發的基于10X平臺的創(chuang)新型微(wei)生物單細胞轉錄組(zu)測序(xu)技術，具有以(yi)下(xia)優勢(shi)：

• 具有完善的質控體系(如圖9a，b)，保證高質量數(shu)據產出(chu)(如圖9c)；

• 具有較(jiao)低(di)的rRNA占比(如圖9d)，保(bao)證具有較(jiao)高的數據利(li)用率(lv)；

• 基于10X微流控平臺，具(ju)有穩定的微流體分隔體系；

• 具有實(shi)驗流程和操作(zuo)簡單快(kuai)捷，減少人(ren)為誤差；

• 周期可控，更(geng)(geng)快的項目(mu)周期和更(geng)(geng)好的數據；

• 本公(gong)司具有完善的配套分析流程，從實驗(yan)到(dao)分析一(yi)站(zhan)式服務。

圖9微生物單細胞測序項目優(you)勢

本公司采用smRNAPSN-seq實(shi)驗方法分析(xi)了在(zai)實(shi)驗處理條件下微(wei)生(sheng)物(wu)菌群(qun)(qun)的(de)(de)異質(zhi)性(xing)，大大增加了發現稀有罕見細胞(bao)亞(ya)群(qun)(qun)的(de)(de)概率，同(tong)時可(ke)以(yi)根據細胞(bao)亞(ya)群(qun)(qun)間的(de)(de)差(cha)異和(he)高表達(da)基因進行選擇敲除，以(yi)此(ci)在(zai)單個細胞(bao)的(de)(de)層次來探(tan)究(jiu)細胞(bao)代謝調控等(deng)通(tong)路(lu)的(de)(de)分子機制。此(ci)外微(wei)生(sheng)物(wu)單細胞(bao)轉錄組測序還可(ke)應用于抗生(sheng)素(su)耐藥機制研究(jiu)、微(wei)生(sheng)物(wu)時序表達(da)、微(wei)生(sheng)物(wu)群(qun)(qun)落(luo)功能定(ding)位，如圖(tu)10所示。

圖10 微生物單細胞轉錄組測序(xu)的(de)應用方向

近年來，隨(sui)著(zhu)微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)單細(xi)胞(bao)(bao)轉(zhuan)錄(lu)(lu)組(zu)(zu)測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)文獻陸陸續續的(de)(de)(de)(de)發(fa)表，單個菌(jun)體或混合菌(jun)體的(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)單細(xi)胞(bao)(bao)轉(zhuan)錄(lu)(lu)組(zu)(zu)的(de)(de)(de)(de)研(yan)究方法已(yi)相(xiang)當成(cheng)熟，擴寬了(le)(le)當前微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)組(zu)(zu)學的(de)(de)(de)(de)相(xiang)關研(yan)究，同(tong)時(shi)也開啟了(le)(le)微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)組(zu)(zu)學測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)新(xin)篇章(zhang)，也顯示(shi)了(le)(le)科研(yan)工作者們(men)對(dui)于微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)組(zu)(zu)學研(yan)究的(de)(de)(de)(de)追求，對(dui)于微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)單細(xi)胞(bao)(bao)轉(zhuan)錄(lu)(lu)組(zu)(zu)測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)技(ji)術有著(zhu)更高的(de)(de)(de)(de)期(qi)望。因(yin)此環境(jing)樣(yang)品(pin)的(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)單細(xi)胞(bao)(bao)轉(zhuan)錄(lu)(lu)組(zu)(zu)測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)成(cheng)為了(le)(le)下一(yi)(yi)個研(yan)究熱點。而(er)環境(jing)樣(yang)品(pin)具有復雜(za)的(de)(de)(de)(de)理化性質(zhi)、豐富的(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)種類(lei)，對(dui)于實驗(yan)樣(yang)品(pin)的(de)(de)(de)(de)預(yu)處理存(cun)在巨(ju)大的(de)(de)(de)(de)考(kao)驗(yan)，后期(qi)我們(men)會進(jin)一(yi)(yi)步克(ke)服相(xiang)關的(de)(de)(de)(de)難點，完善(shan)環境(jing)樣(yang)品(pin)的(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)單細(xi)胞(bao)(bao)轉(zhuan)錄(lu)(lu)組(zu)(zu)測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)技(ji)術，為微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)組(zu)(zu)學的(de)(de)(de)(de)發(fa)展提供更大的(de)(de)(de)(de)助力。

(1)將培養至對數生長期的菌液樣品在4℃，5500×g條件下離心10min；

(2)棄上清，將底部(bu)細菌重懸在5ml新鮮的(de)冷4%甲醛溶(rong)液(1×PBS溶(rong)解(jie))中，4℃震蕩過(guo)夜16h；

(3)次日，將(jiang)細(xi)胞(bao)在(zai)4℃條件下以5500×g離心(xin)10min。去(qu)除上清液(ye)，將(jiang)細(xi)胞(bao)重(zhong)(zhong)新(xin)懸(xuan)浮(fu)(fu)在(zai)1ml新(xin)鮮的冷PBS-RI(0.1U/ul)中(zhong)，并轉移到無酶1.5ml離心(xin)管(guan)中(zhong)，在(zai)4℃，7000×g離心(xin)10min，去(qu)除上清液(ye)，將(jiang)細(xi)胞(bao)重(zhong)(zhong)新(xin)懸(xuan)浮(fu)(fu)在(zai)補(bu)充有0.1U/ul RNase抑制劑(終濃度)的1ml新(xin)鮮的冷0.1M Tris-Hcl-RI(pH7.5)中(zhong)(每一重(zhong)(zhong)懸(xuan)細(xi)菌細(xi)胞(bao)操作(zuo)，至少吹打10次以上，無肉(rou)眼(yan)可見沉淀)。

(4)試劑配制：

①10ml的4%甲醛(quan)溶(rong)(rong)液(ye)(ye)：在15ml離心管中加入0.4ml的甲醛(quan)溶(rong)(rong)液(ye)(ye)，用9.6ml的1xPBS溶(rong)(rong)解；

②10ml的(de)PBS-RI(0.1U/ul)溶(rong)液：在(zai)15ml離心管中加入1000U的(de)RNase抑制(zhi)劑(ji)，補充1xPBS溶(rong)液至10ml；

③10ml的0.1M Tris-Hcl-RI（0.1U/ul）溶(rong)液：在15ml離心管(guan)中加(jia)入1000U的RNA酶抑制劑和1ml 1M Tris-Hcl pH8，補無酶水至10ml。