2024-02-06
近期，四(si)川省(sheng)農(nong)業(ye)科(ke)學(xue)(xue)院植保所在生(sheng)物學(xue)(xue)領域《Biomolecules》發(fa)表新(xin)研(yan)究成果！本研(yan)究利用(yong)BSA-seq分析方(fang)法和基于(yu)SSR構(gou)建(jian)遺(yi)傳圖譜進(jin)行QTL定位(wei)分析方(fang)法，成功地在水稻(dao)(dao)品種IR77298-14-1-2::IRGC117374-1中鑒(jian)定出一個新(xin)的(de)與抗(kang)稻(dao)(dao)曲(qu)病相關的(de)候選(xuan)區間，并(bing)預(yu)測(ce)了該區間的(de)候選(xuan)基因。這一發(fa)現為水稻(dao)(dao)抗(kang)稻(dao)(dao)曲(qu)病育(yu)種提供了重要的(de)信息(xi)和指(zhi)導(dao)。
本研究的(de)BSA測(ce)序和分析由上海派森諾生物科(ke)技股份有限(xian)公(gong)司完(wan)成。
研(yan)究背(bei)景
稻(dao)曲(qu)病（RFS）是(shi)一(yi)種(zhong)由稻(dao)曲(qu)病菌(jun)引起(qi)的(de)(de)水(shui)稻(dao)穗(sui)病，廣泛分布于(yu)世(shi)界上所有(you)水(shui)稻(dao)種(zhong)植區(qu)(qu)，其中最嚴(yan)重的(de)(de)地區(qu)(qu)是(shi)亞洲的(de)(de)水(shui)稻(dao)種(zhong)植區(qu)(qu)。目(mu)前，培(pei)育抗(kang)病品(pin)種(zhong)是(shi)控(kong)制RFS疾病的(de)(de)最有(you)效措(cuo)施(shi)。然而，國內外(wai)關(guan)于(yu)水(shui)稻(dao)RFS抗(kang)性(xing)基因(yin)/QTL的(de)(de)信(xin)息有(you)限。本研究結合(he)BSA分析(xi)和SSR標記，在水(shui)稻(dao)品(pin)種(zhong)IR77298-14-1-2::IRGC117374-1中鑒(jian)定出一(yi)個新的(de)(de)與RFS抗(kang)性(xing)相關(guan)的(de)(de)QTL（qRFS12.01），并在qRFS12.01區(qu)(qu)域預測(ce)到5個含NB-ARC域的(de)(de)疾病耐受蛋(dan)白，這(zhe)對(dui)于(yu)水(shui)稻(dao)稻(dao)曲(qu)病的(de)(de)抗(kang)性(xing)育種(zhong)具(ju)有(you)重要意義(yi)。
研究材料與方法
1、實驗(yan)材料
以抗病品(pin)種IR77298-14-1-2::IRGC117374-1（父(fu)本）和感病品(pin)種“9311”（母本）為(wei)雜交材料，獲得(de)F2分(fen)離群體(ti)
2、測序(xu)平臺
Illumina NovaSeq
3、分析內容
BSA分析、基于SSR構建遺(yi)傳連鎖圖譜、QTL分析、候選基因注釋
研究結果
1. IR77298-14-1-2：：IRGC117374-1對U. virens的抗性遺傳特征
以抗(kang)性(xing)品種IR77298-14-1-2::IRGC117374-1為父(fu)本(ben)，感(gan)病(bing)品種9311為母本(ben)進行雜交，利用U. virens鑒(jian)定親(qin)本(ben)和(he)子代的抗(kang)性(xing)。所(suo)有F1代植物均為易感(gan)（S）或(huo)高感(gan)（HS），未發現(xian)抗(kang)性(xing)植株，表明水(shui)稻(dao)控(kong)制RFS抗(kang)性(xing)基(ji)因(yin)是隱性(xing)遺(yi)(yi)傳的。在F2代群(qun)體的201株水(shui)稻(dao)中(zhong)，抗(kang)性(xing)（R）和(he)感(gan)病(bing)（S）分離比接近(jin)1:2.1，這與單基(ji)因(yin)遺(yi)(yi)傳分離的理論比例（1:3）不一致。結果表明，IR77298-14-1-2::IRGC117374-1對(dui)RFS的抗(kang)性(xing)受(shou)多(duo)個(ge)基(ji)因(yin)座控(kong)制。
圖1 接種(zhong)21天后親本和(he)F1代水稻(dao)稻(dao)曲病的癥狀
圖2 在不同抗性水(shui)平下，F2群(qun)體中水(shui)稻(dao)植株(zhu)的(de)數量
2. BSA-Seq數據(ju)統計及變異檢測
樣本原(yuan)始數據(ju)共包含258,279,848條(tiao)reads，不同樣本的(de)高質量(liang)數據(ju)大小在49.35-79.45 Mb。GC含量(liang)和(he)Q30分別(bie)為(wei)44.43％-44.90％和(he)93.59％-94.05％。與(yu)日本晴進行比對，每個(ge)樣本的(de)比對率(lv)都(dou)在98.25％以(yi)上，覆蓋率(lv)為(wei)90.84％-97.21％。在9311、IR77298-14-1-2::IRGC117374-1、R-pool 和(he)S-pool 中分別(bie)檢測到2,954,310、2,913,481、3,482,716和(he)3,504,278個(ge)SNPs，462,940、454,802、542,475和(he)543,968個(ge)indels。
表(biao)1 BSA-seq樣本(ben)的測序數據統(tong)計
表2 每個(ge)樣本(ben)的(de)基因(yin)型統計（SNPs）
表3 每個樣本(ben)的基因(yin)型統(tong)計（Indels）
3. BSA-Seq的關(guan)聯分(fen)析
使(shi)用ED值分(fen)(fen)析(xi)法進行BSA性狀定(ding)位分(fen)(fen)析(xi)，在12號染色體上共鑒(jian)(jian)定(ding)到(dao)(dao)3個(ge)相關區(qu)(qu)域，區(qu)(qu)間(jian)范圍分(fen)(fen)別為0.57 Mb（10.58-11.15 Mb）、3.07 Mb（16.56-19.63 Mb）和(he)2.21 Mb（21.49-23.70 Mb），分(fen)(fen)別包含26、109和(he)125個(ge)基(ji)因。在6號染色體上鑒(jian)(jian)定(ding)到(dao)(dao)1個(ge)相關區(qu)(qu)域，范圍在0.03-0.81 Mb（0.78 Mb），含有(you)64個(ge)基(ji)因。在這些候選(xuan)區(qu)(qu)間(jian)中(zhong)共鑒(jian)(jian)定(ding)出324個(ge)候選(xuan)基(ji)因。
表4 通(tong)過(guo)BSA-seq關聯(lian)分析鑒定的抗性候選(xuan)區間(jian)
4. 基于SSR標記的RFS抗性QTL鑒定
本(ben)研究利(li)用871個SSR標(biao)記(ji)(ji)對抗(kang)(kang)性親本(ben)IR77298-14-1-2:IRGC117374-1和感病親本(ben)9311的DNA多態性進行檢測，其中RM5341、RM28195、RM1158、RM1103、RM28472和RM1047在樣本(ben)間(jian)(jian)具有多態。利(li)用6個SSR標(biao)記(ji)(ji)分析(xi)F2群體(ti)的基因(yin)型(xing)并構建連鎖圖(tu)譜，根據抗(kang)(kang)RFS的表(biao)型(xing)，獲得QTL定(ding)位區間(jian)(jian)（qRFS12.01），區間(jian)(jian)位于12號染色(se)體(ti)上的18,152,114 bp-19,155,838 bp。qRFS12.01對RFS抗(kang)(kang)性的表(biao)型(xing)效應達到28.74%，表(biao)明與qRFS12.01連鎖的SSR標(biao)記(ji)(ji)(RM5341和RM28195)可以作(zuo)為水稻RFS抗(kang)(kang)性輔助選(xuan)擇育種(zhong)的有效分子標(biao)記(ji)(ji)。
圖3 與抗性相(xiang)關SSR標(biao)記的(de)擴(kuo)增結(jie)果
圖4 抗稻曲病連鎖圖譜(pu)的QTL分析(xi)
5. 候選基(ji)因的鑒定
BSA-seq和(he)(he)SSR標(biao)記定(ding)位的重疊(die)區域(yu)被(bei)做(zuo)為(wei)最終候選區間(jian)，候選區間(jian)位于12號(hao)染(ran)色(se)體的18.152-19.156 Mb，該(gai)區域(yu)大小為(wei)1.004Mb，即SSR標(biao)記RM28195和(he)(he)RM5341(qRFS12.01)之間(jian)的區域(yu)，包含(han)41個候選基因，有22個成功被(bei)注釋(shi)，6個基因與RFS抗性(xing)密切相(xiang)關。其中，LOC_Os12g30590、LOC_Os12g30760、LOC_Os12g31160、LOC_Os12g31200和(he)(he)LOC_Os12g31620編(bian)碼(ma)抗病(bing)蛋白，分(fen)別是(shi)含(han)有NB-ARC結構域(yu) 的RGA2、At4g10780、Pik-2-like、RGA4-like和(he)(he)RPM1，LOC_Os12g30570編(bian)碼(ma) STY13-like。
圖5 候選基因(yin)的GO注釋
表5 RFS抗性相關候選基因
6. 候選基因(yin)的表達量(liang)分析
采用RT-PCR方法檢測抗病親(qin)本IR77298-14-1-2：：IRGC117374-1和感病親(qin)本9311中(zhong)6個候選基因(yin)(yin)的表達量。分析(xi)鑒定出對U. virens感染有(you)響應的六個候選基因(yin)(yin)，其中(zhong)5個（LOC_Os12g30590、LOC_Os12g31200、LOC_Os12g30760、LOC_Os12g31160 和 LOC_Os12g31620）在接種(zhong)U. virens的抗病親(qin)本 IR77298-14-1-2::IRGC117374-1 中(zhong)顯著上(shang)調。結果表明，這5種(zhong)基因(yin)(yin)與抗病性(xing)密(mi)切相關。
圖6 候選基因的qRT-PCR分析
結 論
本研究結(jie)合BSA分析和SSR標(biao)記(ji)，在IR77298- 14-1-2::IRGC117374-1中鑒定了一個針(zhen)對(dui)RFS抗性的(de)新的(de)QTL qRFS12.01，并預(yu)測了與抗性相關的(de)候選基因。qRFS12.01連鎖的(de)SSR標(biao)記(ji)可用(yong)于抗RFS品種的(de)標(biao)記(ji)輔助(zhu)篩選。這些研究結(jie)果為克隆控制抗RFS基因位點(dian)和培育(yu)抗RFS的(de)水(shui)稻(dao)品種提供了重要信息。
如需進一步討論，歡迎發(fa)郵件或者致電我(wo)們(men)喲(yo)（郵箱地址：genome_support@doudin.cn，聯系電話：021-80118168-8615）！
文章索引：Fu, R, Zhao, L, Chen, C, et al. Conjunctive Analysis of BSA-Seq and SSR Markers Unveil the Candidate Genes for Resistance to Rice False Smut. Biomolecules. 2024: 14: 79.
