流式細(xi)胞術（Flow cytometry，FCM）是通過利用流式細(xi)胞儀對(dui)處于快速直(zhi)線流動狀態中的(de)(de)單列(lie)細(xi)胞或生物(wu)顆粒進行逐(zhu)個(ge)、多參(can)數、快速的(de)(de)定(ding)(ding)性、定(ding)(ding)量(liang)分析或分選的(de)(de)技術。

分(fen)選(xuan)(xuan)(xuan)型流(liu)式(shi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)儀一般由液流(liu)系統、光(guang)(guang)(guang)(guang)路系統、檢(jian)測(ce)(ce)(ce)分(fen)析系統和分(fen)選(xuan)(xuan)(xuan)系統4部分(fen)組(zu)成(cheng)(cheng)，其基本(ben)原理是(shi)通(tong)(tong)(tong)(tong)過基于層流(liu)規(gui)律(lv)的(de)流(liu)體動力(li)學聚焦，將帶分(fen)選(xuan)(xuan)(xuan)樣(yang)本(ben)注(zhu)入(ru)流(liu)動液體（稱(cheng)為(wei)鞘液）層流(liu)中(zhong)間的(de)流(liu)室中(zhong)，鞘液可(ke)幫助縮(suo)窄細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)流(liu)，從而將細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)/顆粒組(zu)織成(cheng)(cheng)一行(xing)大(da)致(zhi)單(dan)行(xing)的(de)流(liu)線(xian)；單(dan)個細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)/顆粒依(yi)次快速通(tong)(tong)(tong)(tong)過激光(guang)(guang)(guang)(guang)束，檢(jian)測(ce)(ce)(ce)器會(hui)(hui)(hui)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)或顆粒的(de)散(san)(san)射(she)光(guang)(guang)(guang)(guang)。前(qian)面的(de)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)器檢(jian)測(ce)(ce)(ce)前(qian)向(xiang)散(san)(san)射(she)光(guang)(guang)(guang)(guang) （FS），放置在側(ce)面的(de)多個檢(jian)測(ce)(ce)(ce)器檢(jian)測(ce)(ce)(ce)側(ce)向(xiang)散(san)(san)射(she)光(guang)(guang)(guang)(guang)（SS），熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)器則檢(jian)測(ce)(ce)(ce)被染色(se)的(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)/顆粒發射(she)的(de)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)。通(tong)(tong)(tong)(tong)過濾(lv)光(guang)(guang)(guang)(guang)片將FS、SS以(yi)及熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)分(fen)成(cheng)(cheng)既定(ding)的(de)波(bo)長并分(fen)配通(tong)(tong)(tong)(tong)道(dao)。熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)會(hui)(hui)(hui)被過濾(lv)，以(yi)使各傳(chuan)感(gan)器僅檢(jian)測(ce)(ce)(ce)特定(ding)波(bo)長的(de)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)。這(zhe)些傳(chuan)感(gan)器稱(cheng)為(wei)光(guang)(guang)(guang)(guang)電倍增管(guan)（PMT） ，熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)會(hui)(hui)(hui)被過濾(lv)，以(yi)使各 PMT 僅檢(jian)測(ce)(ce)(ce)特定(ding)波(bo)長的(de)光(guang)(guang)(guang)(guang)。PMT 會(hui)(hui)(hui)將光(guang)(guang)(guang)(guang)子能量轉換成(cheng)(cheng)電信號(hao)，即電壓。通(tong)(tong)(tong)(tong)過計算機進行(xing)實時展示、分(fen)析和儲存處(chu)理后，將攜帶所需(xu)分(fen)選(xuan)(xuan)(xuan)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)信號(hao)的(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)/顆粒帶上電荷(he)并通(tong)(tong)(tong)(tong)過兩個偏轉板產(chan)生(sheng)(sheng)的(de)靜電場通(tong)(tong)(tong)(tong)道(dao)，發生(sheng)(sheng)偏轉，落入(ru)收(shou)集管(guan)中(zhong)（圖1）。

圖1 流式細胞術示意圖^[1]

流式細(xi)(xi)胞(bao)術可以提供(gong)待分析(xi)的顆(ke)粒的結構和化學(xue)特性的信(xin)息(xi)。雖然最常(chang)見的應用(yong)是單(dan)個哺乳動(dong)物(wu)(wu)細(xi)(xi)胞(bao)，但它也適用(yong)于植(zhi)物(wu)(wu)、細(xi)(xi)菌、酵母(mu)和病毒以及線蟲和果蠅等整個生物(wu)(wu)體的研(yan)究。相(xiang)反，也可以分析(xi)細(xi)(xi)胞(bao)的某些部分，例如分離的細(xi)(xi)胞(bao)核、染色體、細(xi)(xi)胞(bao)器或細(xi)(xi)胞(bao)外囊泡(pao)。

（1）細(xi)(xi)胞。流式細(xi)(xi)胞術非(fei)常適合分(fen)(fen)(fen)選天然懸(xuan)浮細(xi)(xi)胞或(huo)者是(shi)已制(zhi)備好的單細(xi)(xi)胞懸(xuan)浮液。通過細(xi)(xi)胞自發(fa)熒光(guang)或(huo)加入(ru)相應(ying)染料，可以在(zai)(zai)分(fen)(fen)(fen)析時排除死細(xi)(xi)胞從(cong)而保持分(fen)(fen)(fen)選得(de)到高活力細(xi)(xi)胞懸(xuan)液。同時，細(xi)(xi)胞任(ren)何部分(fen)(fen)(fen)都(dou)可以用熒光(guang)探針標記，但(dan)是(shi)流式細(xi)(xi)胞術提供整個細(xi)(xi)胞的信息，沒有熒光(guang)的定位，無法判(pan)斷其(qi)在(zai)(zai)細(xi)(xi)胞內分(fen)(fen)(fen)布。為(wei)了(le)確定熒光(guang)的位置，需(xu)要利(li)用熒光(guang)或(huo)共聚焦顯微鏡或(huo)成(cheng)像流式細(xi)(xi)胞術進(jin)行分(fen)(fen)(fen)析。

（2）細(xi)胞(bao)(bao)核(he)。在(zai)(zai)實驗研究中有時研究對象僅有DNA 或核(he)蛋白，或者在(zai)(zai)單細(xi)胞(bao)(bao)測序中因(yin)(yin)為樣本限制無法(fa)制備細(xi)胞(bao)(bao)懸(xuan)液，在(zai)(zai)這種(zhong)情(qing)況下，可以選(xuan)擇分(fen)離純(chun)化得到細(xi)胞(bao)(bao)核(he)懸(xuan)液，對其進(jin)行流式分(fen)選(xuan)，而(er)(er)且(qie)細(xi)胞(bao)(bao)核(he)通常(chang)具有較少的(de)非特異性(xing)結合，因(yin)(yin)此背(bei)景更干凈。與(yu)整個細(xi)胞(bao)(bao)相比，分(fen)離的(de)細(xi)胞(bao)(bao)核(he)通常(chang)具有更好的(de)CV，從而(er)(er)更容(rong)易進(jin)行分(fen)析。

（3）細(xi)(xi)胞器。整個(ge)細(xi)(xi)胞內(nei)的細(xi)(xi)胞器都可以(yi)通(tong)過用熒光染(ran)料標記(ji)的抗體或(huo)熒光探針(zhen)染(ran)色來(lai)特異性(xing)鑒定(ding)分選，線粒(li)體、溶酶(mei)體、內(nei)質網、高爾基(ji)體等都可以(yi)通(tong)過染(ran)色被識別，但因(yin)為(wei)細(xi)(xi)胞器大(da)部(bu)分為(wei)未經固(gu)定(ding)，在分析中不(bu)僅需(xu)(xu)要評估背景熒光的陰(yin)性(xing)對(dui)照，也需(xu)(xu)要增加確保(bao)染(ran)色成(cheng)功的陽性(xing)對(dui)照。

（4）染(ran)(ran)色(se)(se)(se)體(ti)。通過(guo)具有不同堿(jian)基(ji)對特異(yi)性(xing)的(de)(de)DNA結合染(ran)(ran)料(liao)染(ran)(ran)色(se)(se)(se)，經(jing)流式(shi)細胞(bao)術可以分(fen)析得到染(ran)(ran)色(se)(se)(se)體(ti)大小和堿(jian)基(ji)對情況，同時因(yin)為流式(shi)細胞(bao)術可以更快(kuai)速簡便的(de)(de)分(fen)析中期染(ran)(ran)色(se)(se)(se)體(ti)進(jin)行倍(bei)性(xing)分(fen)析，可以快(kuai)速準確檢測同一物種(zhong)范圍內不同倍(bei)性(xing)的(de)(de)樣品

（5）細(xi)(xi)胞(bao)外囊泡（extracellular vesicles，EVs）。EVs 不僅攜(xie)帶母體細(xi)(xi)胞(bao)多種特征性生(sheng)物(wu)信息分子，而且可(ke)以將(jiang)這些分子傳(chuan)遞給(gei)其(qi)他(ta)細(xi)(xi)胞(bao)，在(zai)(zai)許多生(sheng)理病理學過(guo)程中(zhong)充當(dang)生(sheng)物(wu)信息傳(chuan)遞載體。為了研究(jiu) EVs在(zai)(zai)免疫學中(zhong)的(de)作用(yong)，流式細(xi)(xi)胞(bao)術是對表達某些抗原的(de)EVs進行(xing)準確的(de)定性及定量的(de)首(shou)選技術。EVs主要由脂(zhi)質(zhi)膜和(he)胞(bao)質(zhi)內容物(wu)組成，其(qi)中(zhong)可(ke)能(neng)包括(kuo)細(xi)(xi)胞(bao)器，因(yin)此，可(ke)以通(tong)過(guo)標(biao)記脂(zhi)質(zhi)、特定膜蛋白(bai)或特定細(xi)(xi)胞(bao)器熒光和(he)光散(san)射(she)(she)(she)(she)（側向(xiang)(xiang)散(san)射(she)(she)(she)(she)或直角(jiao)光散(san)射(she)(she)(she)(she)優(you)于正(zheng)向(xiang)(xiang)散(san)射(she)(she)(she)(she)）來識(shi)別和(he)檢(jian)測(ce)EVs。但是普通(tong)流式檢(jian)測(ce)檢(jian)測(ce)下限為 200-500 nm，無法檢(jian)測(ce)小EVs（30-150 nm），因(yin)此在(zai)(zai)分析此類微(wei)粒時，目前有通(tong)過(guo)紫光側向(xiang)(xiang)角(jiao)散(san)射(she)(she)(she)(she)光替代前向(xiang)(xiang)散(san)射(she)(she)(she)(she)光檢(jian)測(ce)以及其(qi)他(ta)超高靈敏流式檢(jian)測(ce)裝置的(de)流式細(xi)(xi)胞(bao)儀。

（1）樣本準備：根據實驗需(xu)求準備帶(dai)分選(xuan)樣本，若為細(xi)(xi)胞(bao)樣本需(xu)保證細(xi)(xi)胞(bao)樣本的(de)純(chun)度(du)和活(huo)力；

（2）熒光標(biao)記：利用易于檢測的(de)標(biao)記直接標(biao)記細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，以區分(fen)不(bu)同細(xi)(xi)胞(bao)(bao)便于后續分(fen)析分(fen)選，目前利用不(bu)同光譜(pu)性質的(de)熒光團標(biao)記不(bu)同細(xi)(xi)胞(bao)(bao)是最(zui)(zui)常見和最(zui)(zui)成熟的(de)技術(shu)，熒光標(biao)記主要(yao)包括熒光標(biao)記偶(ou)聯抗體、細(xi)(xi)胞(bao)(bao)示蹤染料(liao)、熒光蛋白；

（3）流(liu)式細胞(bao)儀(yi)設置(zhi)：根(gen)據標記物的(de)特性，設置(zhi)流(liu)式細胞(bao)儀(yi)的(de)參數，包括激光(guang)波長、濾(lv)光(guang)片設置(zhi)等。確保儀(yi)器正常工作并準(zhun)備(bei)好(hao)進行檢測分析；

（4）樣本分析：將標記(ji)后的細胞(bao)上樣，儀器通過激光(guang)(guang)照射檢(jian)測細胞(bao)熒(ying)光(guang)(guang)信號。根(gen)據(ju)標記(ji)物的特(te)異性，可以識別(bie)和分析不同類型的細胞(bao)。

（5）設定分(fen)選(xuan)參數(shu)：根據實驗(yan)需要(yao)，設置流式(shi)細胞儀的(de)分(fen)選(xuan)參數(shu)，包括調(diao)整補(bu)償、設定篩(shai)選(xuan)門、分(fen)選(xuan)速度等，確保分(fen)選(xuan)的(de)準確性(xing)和有效性(xing)；

（6）分(fen)選(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)收集(ji)(ji)：根據設定的(de)分(fen)選(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)參(can)數(shu)，進(jin)行細胞的(de)有選(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)擇性收集(ji)(ji)和分(fen)選(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)。可以將目標細胞單(dan)獨收集(ji)(ji)或排(pai)除非(fei)目標細胞；

（7）分選后(hou)處(chu)理：對分選后(hou)的細胞進行鏡(jing)檢觀察細胞狀態(tai)，對其進一步處(chu)理和(he)分析，確保所得到的細胞符合實(shi)驗(yan)(yan)要求后(hou)，進行下一步實(shi)驗(yan)(yan)。

圖2 流式分選基本流程示意圖^[2]

（1）調整(zheng)樣(yang)本重懸液及收(shou)(shou)集(ji)(ji)(ji)液組分。樣(yang)本制備的(de)目的(de)是獲得高活性(xing)、低雜質、少聚集(ji)(ji)(ji)的(de)單(dan)細(xi)胞懸液。根據不(bu)同樣(yang)本可(ke)選(xuan)擇不(bu)同緩沖液作為(wei)(wei)(wei)樣(yang)本重懸液，通常情(qing)況選(xuan)擇無(wu)Ca2+Mg2+的(de)1×PBS加(jia)入(ru)1%BSA作為(wei)(wei)(wei)重懸液；分選(xuan)后所得細(xi)胞已(yi)經歷過激(ji)(ji)光照射、噴嘴剪切(qie)力、液滴充電、入(ru)液沖擊等不(bu)利刺激(ji)(ji)，為(wei)(wei)(wei)盡可(ke)能恢復細(xi)胞活性(xing)，收(shou)(shou)集(ji)(ji)(ji)液可(ke)選(xuan)擇完全培養(yang)基，若(ruo)后續需進(jin)行(xing)高通量測序，則更建議(yi)選(xuan)擇無(wu)Ca2+Mg2+1×PBS加(jia)入(ru)1%BSA、RI作為(wei)(wei)(wei)收(shou)(shou)集(ji)(ji)(ji)液進(jin)行(xing)收(shou)(shou)集(ji)(ji)(ji)；

（2）液(ye)流(liu)(liu)。在流(liu)(liu)式分(fen)(fen)選(xuan)(xuan)中，液(ye)流(liu)(liu)作為細胞(bao)的載體和分(fen)(fen)選(xuan)(xuan)的對(dui)象，影響著分(fen)(fen)選(xuan)(xuan)所有四個指標（純度、速度、得率及活性）。液(ye)流(liu)(liu)的穩(wen)(wen)定(ding)是保證分(fen)(fen)選(xuan)(xuan)準確進(jin)行的基礎，因此，形態正常且(qie)穩(wen)(wen)定(ding)的液(ye)流(liu)(liu)是得到純度高、活性好細胞(bao)的關(guan)鍵(jian)。維持(chi)液(ye)流(liu)(liu)穩(wen)(wen)定(ding)的關(guan)鍵(jian)就是液(ye)路(lu)與鞘(qiao)液(ye)系統穩(wen)(wen)定(ding)、保持(chi)溫度恒定(ding)、必(bi)要時進(jin)行無菌分(fen)(fen)選(xuan)(xuan)；

（3）假陽(yang)(yang)性。進行基(ji)于熒光信號(hao)(hao)的分選(xuan)時，假陽(yang)(yang)性信號(hao)(hao)的干擾是分選(xuan)后存活(huo)(huo)率(lv)低的主(zhu)要原(yuan)因(yin)，而熒光假陽(yang)(yang)性信號(hao)(hao)主(zhu)要有3種來源：樣品中自發(fa)熒光的死細胞、粘(zhan)連(lian)后增(zeng)加(jia)熒光值的陰性樣品和(he)經過分選(xuan)后致死的正常細胞，為減少由于非活(huo)(huo)性細胞引起的假陽(yang)(yang)性，最(zui)有效(xiao)方(fang)法是引入與(yu)目的探針不同顏色的陰性選(xuan)擇探針，將(jiang)非活(huo)(huo)性細胞去(qu)除(chu)；

（4）液(ye)(ye)(ye)滴(di)延(yan)(yan)遲(chi)(chi)。液(ye)(ye)(ye)滴(di)延(yan)(yan)遲(chi)(chi)是(shi)從(cong)目(mu)標細胞被檢測(ce)到所在液(ye)(ye)(ye)滴(di)被充電所用的(de)時間，是(shi)分選(xuan)精確性的(de)直(zhi)接影響因素。在調(diao)節液(ye)(ye)(ye)滴(di)延(yan)(yan)遲(chi)(chi)前，應調(diao)整監測(ce)激光(guang)的(de)照(zhao)射角度，使四路模擬(ni)分選(xuan)液(ye)(ye)(ye)流(liu)被均等照(zhao)亮。否(fou)則(ze)會使分選(xuan)液(ye)(ye)(ye)流(liu)和中心液(ye)(ye)(ye)流(liu)的(de)照(zhao)度不同，影響液(ye)(ye)(ye)滴(di)延(yan)(yan)遲(chi)(chi)的(de)設(she)置[3]；

（5）液滴收集。含目(mu)標(biao)細胞的(de)液滴在(zai)斷點處(chu)需進行(xing)充電(dian)(dian)，在(zai)匯入收集器后(hou)又(you)發生放電(dian)(dian)，對(dui)其中(zhong)細胞的(de)狀(zhuang)態有一定影響。因此在(zai)分選較為特殊的(de)樣(yang)本時，根據樣(yang)本不(bu)同特性調整儀(yi)器設置，例如使用低壓力、大(da)噴嘴(zui)以(yi)及在(zai)保證分選液流偏(pian)(pian)轉(zhuan)角度的(de)前(qian)提下(xia)使用較小(xiao)的(de)充電(dian)(dian)量，相(xiang)應地增(zeng)大(da)偏(pian)(pian)轉(zhuan)電(dian)(dian)壓，以(yi)減少電(dian)(dian)荷對(dui)細胞的(de)刺(ci)激；

（6）平(ping)衡純(chun)(chun)度(du)、濃度(du)、分(fen)(fen)選時(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)。在(zai)流(liu)式分(fen)(fen)選過(guo)程中(zhong)，需(xu)要最(zui)大限度(du)地提高分(fen)(fen)選樣本(ben)的濃度(du)和純(chun)(chun)度(du)，并盡量減少流(liu)式分(fen)(fen)選的時(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)。但因為濃度(du)和純(chun)(chun)度(du)相互影(ying)響，且(qie)都取決于速度(du)，所以三者(zhe)之(zhi)間(jian)(jian)不(bu)(bu)能同(tong)時(shi)(shi)(shi)最(zui)大化。上樣速度(du)過(guo)高會使得分(fen)(fen)選回收(shou)率下降(jiang)，造成部(bu)分(fen)(fen)陽性細胞被丟棄，分(fen)(fen)選速度(du)過(guo)低會延長分(fen)(fen)選時(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)，不(bu)(bu)利(li)于維(wei)持細胞活(huo)性。因此(ci)在(zai)分(fen)(fen)選實驗中(zhong)，不(bu)(bu)能同(tong)時(shi)(shi)(shi)對(dui)純(chun)(chun)度(du)、濃度(du)、時(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)進(jin)行優化，需(xu)要在(zai)三者(zhe)之(zhi)間(jian)(jian)找到一個折中(zhong)方案（如圖3）；

圖3 平衡純度、濃度、分選時間^[4]

派森諾流(liu)式(shi)(shi)分(fen)(fen)選(xuan)平臺引入Beckman CytoFLEX SRT 全自(zi)動(dong)(dong)流(liu)式(shi)(shi)細胞(bao)(bao)分(fen)(fen)選(xuan)儀(yi)，其配置(zhi)(zhi)四根高功(gong)率固態激光器(qi)，配置(zhi)(zhi)FSC、SSC、VSSC以(yi)及不(bu)少于15 個熒光探測(ce)(ce)器(qi)、四路(lu)分(fen)(fen)選(xuan)模式(shi)(shi)、可(ke)(ke)采用混合分(fen)(fen)選(xuan)邏(luo)輯（純(chun)度(du)模式(shi)(shi)、富(fu)集模式(shi)(shi)和(he)單(dan)細胞(bao)(bao)模式(shi)(shi)）；儀(yi)器(qi)可(ke)(ke)以(yi)在(zai)很(hen)短時間(jian)內檢測(ce)(ce)大量(liang)(liang)細胞(bao)(bao)，對同一個細胞(bao)(bao)進(jin)行多參數分(fen)(fen)析(xi)，并精準(zhun)的分(fen)(fen)選(xuan)到相應目的細胞(bao)(bao)，在(zai)滿足日常實(shi)(shi)驗多色分(fen)(fen)析(xi)和(he)分(fen)(fen)選(xuan)的需(xu)(xu)求(qiu)的同時也能滿足當下(xia)熱點應用小顆粒(li)分(fen)(fen)析(xi)分(fen)(fen)選(xuan)方面的需(xu)(xu)求(qiu)，可(ke)(ke)以(yi)完美提(ti)供(gong)0.1-50um細胞(bao)(bao)顆粒(li)的高動(dong)(dong)態范圍檢測(ce)(ce)；頂(ding)級的信號和(he)電子(zi)處理系統，可(ke)(ke)以(yi)獲(huo)得最(zui)優化(hua)的分(fen)(fen)選(xuan)得率和(he)純(chun)度(du)；儀(yi)器(qi)具有高數據分(fen)(fen)辨率和(he)信號精度(du)，保證微弱熒光信號的識別；儀(yi)器(qi)配置(zhi)(zhi)精準(zhun)的高通量(liang)(liang)克隆分(fen)(fen)選(xuan)技術Cyclone，最(zui)多可(ke)(ke)以(yi)分(fen)(fen)選(xuan)到384孔板，真正實(shi)(shi)現單(dan)克隆分(fen)(fen)選(xuan)。該儀(yi)器(qi)多參數分(fen)(fen)析(xi)和(he)高通量(liang)(liang)分(fen)(fen)選(xuan)功(gong)能，能夠滿足不(bu)同樣本(ben)單(dan)細胞(bao)(bao)測(ce)(ce)序的科研需(xu)(xu)求(qiu)，提(ti)升實(shi)(shi)驗效(xiao)率和(he)準(zhun)確(que)性。

圖4 Beckman CytoFLEX SRT 全自動流式細胞分選儀