自20世紀(ji)90年代以(yi)來(lai)，隨(sui)著高通量測序(xu)技(ji)術的(de)迅(xun)(xun)猛發展(zhan)，轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組學(xue)作為研究(jiu)(jiu)(jiu)細胞(bao)內(nei)(nei)所有轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)RNA的(de)學(xue)科逐漸嶄露頭角。研究(jiu)(jiu)(jiu)者們開始全(quan)面揭示基因表(biao)達模式(shi)和調控網(wang)絡。然而，傳統轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組學(xue)技(ji)術無法研究(jiu)(jiu)(jiu)細胞(bao)內(nei)(nei)不同亞細胞(bao)結構和環境對基因表(biao)達的(de)影響。為了更全(quan)面地理(li)解(jie)基因表(biao)達的(de)調控過(guo)程，空間(jian)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組學(xue)迅(xun)(xun)速(su)興起(qi)，致力于揭示基因在(zai)細胞(bao)內(nei)(nei)的(de)空間(jian)分布、亞細胞(bao)位置和相互作用，為理(li)解(jie)基因表(biao)達的(de)空間(jian)調控機制提供了新(xin)的(de)視角。

轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組技術(shu)的(de)(de)(de)發展經歷了(le)三個(ge)(ge)重(zhong)(zhong)要階段(duan)：第一(yi)(yi)個(ge)(ge)階段(duan)是(shi)對(dui)大量(liang)混合細(xi)胞(bao)進行轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組測序(xu)（Bulk RNA），獲得的(de)(de)(de)是(shi)一(yi)(yi)個(ge)(ge)大細(xi)胞(bao)群(qun)體中(zhong)(zhong)單(dan)(dan)個(ge)(ge)基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)平均(jun)表(biao)(biao)達(da)水(shui)平，但(dan)無法展示單(dan)(dan)個(ge)(ge)細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)表(biao)(biao)達(da)水(shui)平。第二個(ge)(ge)階段(duan)是(shi)單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組測序(xu)（Single cell RNA sequencing，scRNA-seq），能夠(gou)(gou)在(zai)單(dan)(dan)個(ge)(ge)細(xi)胞(bao)水(shui)平上構建每個(ge)(ge)細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達(da)譜，反映(ying)細(xi)胞(bao)間(jian)(jian)的(de)(de)(de)異質性。但(dan)是(shi)在(zai)單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)懸液制備過程(cheng)中(zhong)(zhong)會(hui)丟失空(kong)(kong)間(jian)(jian)位置信息，而(er)這(zhe)(zhe)是(shi)器官功能的(de)(de)(de)關鍵特征之一(yi)(yi)。在(zai)對(dui)這(zhe)(zhe)一(yi)(yi)需求的(de)(de)(de)驅動下(xia)，Joakim Lundeberg課題組于2016年提出(chu)了(le)空(kong)(kong)間(jian)(jian)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組學(xue)的(de)(de)(de)概(gai)念(nian)，并發表(biao)(biao)了(le)第一(yi)(yi)個(ge)(ge)基(ji)于原位捕獲RNA的(de)(de)(de)空(kong)(kong)間(jian)(jian)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組學(xue)技術(shu)。空(kong)(kong)間(jian)(jian)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組測序(xu)的(de)(de)(de)出(chu)現使細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)空(kong)(kong)間(jian)(jian)位置信息和基(ji)因(yin)表(biao)(biao)達(da)數(shu)據(ju)相(xiang)結合，可以同(tong)時獲得細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)空(kong)(kong)間(jian)(jian)位置信息和基(ji)因(yin)表(biao)(biao)達(da)數(shu)據(ju)。這(zhe)(zhe)為(wei)(wei)組織細(xi)胞(bao)功能、微(wei)環境(jing)互作、發育過程(cheng)譜系追蹤以及疾病(bing)病(bing)理(li)(li)學(xue)等多(duo)個(ge)(ge)領(ling)域提供了(le)重(zhong)(zhong)要的(de)(de)(de)研究(jiu)手段(duan)。隨后，一(yi)(yi)系列能夠(gou)(gou)進行高(gao)通量(liang)原位RNA檢測分析的(de)(de)(de)技術(shu)都被歸為(wei)(wei)空(kong)(kong)間(jian)(jian)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組學(xue)技術(shu)的(de)(de)(de)范疇。盡管這(zhe)(zhe)些技術(shu)的(de)(de)(de)原理(li)(li)各(ge)不相(xiang)同(tong)，但(dan)它(ta)們有一(yi)(yi)個(ge)(ge)共同(tong)點，即記錄(lu)所檢測RNA分子的(de)(de)(de)空(kong)(kong)間(jian)(jian)位置信息。

圖(tu)1 Bulk，Single Cell和Spatial分析的維度比較

20世紀90年(nian)(nian)代(dai)后期，一些(xie)關于空(kong)(kong)間(jian)(jian)轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)組學的(de)文章(zhang)從激(ji)光捕獲(huo)顯(xian)微解剖(pou)(LCM)、微陣(zhen)列(lie)或RNA-seq和(he)(he)單(dan)分(fen)子(zi)熒(ying)光原(yuan)位雜交(smFISH)等技(ji)術(shu)(shu)的(de)使用開啟了空(kong)(kong)間(jian)(jian)轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)組學的(de)發(fa)展歷(li)程。20世紀80年(nian)(nian)代(dai)的(de)一些(xie)技(ji)術(shu)(shu)，雖然現(xian)在(zai)并不(bu)稱為(wei)(wei)“空(kong)(kong)間(jian)(jian)轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)組學”，但它也是(shi)在(zai)空(kong)(kong)間(jian)(jian)中獲(huo)得轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)信息。加(jia)州(zhou)理工（Caltech）大學Lambda Moses和(he)(he)Lior Pachter老師在(zai)其在(zai)線電子(zi)書Museum of Spatial Transcriptomics中將這(zhe)部分(fen)空(kong)(kong)間(jian)(jian)轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)組技(ji)術(shu)(shu)稱為(wei)(wei)“前傳時(shi)代(dai)”[1]。前傳時(shi)代(dai)的(de)技(ji)術(shu)(shu)為(wei)(wei)我(wo)們刻畫了空(kong)(kong)間(jian)(jian)轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)組的(de)一般技(ji)術(shu)(shu)特點：成像，定位，表達(da)量。同時(shi)，能夠看到“前傳時(shi)代(dai)”的(de)空(kong)(kong)間(jian)(jian)轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)組一直在(zai)努力(li)的(de)一個(ge)方向是(shi)成像和(he)(he)單(dan)細胞（分(fen)辨(bian)率(lv)），而表達(da)量往往不(bu)是(shi)高通量獲(huo)得的(de)。盡管由于受限于分(fen)辨(bian)率(lv)，易操作性(xing)，可(ke)用的(de)軟(ruan)件，豐富的(de)數據庫等原(yuan)因，尤其是(shi)基于NGS的(de)高通量表達(da)量的(de)獲(huo)取在(zai)前傳時(shi)代(dai)中是(shi)沒有的(de)，使得“前傳時(shi)代(dai)”很多技(ji)術(shu)(shu)已(yi)經式微，但“前傳時(shi)代(dai)”還是(shi)進行許多有益的(de)嘗(chang)試，甚至可(ke)以說(shuo)是(shi)為(wei)(wei)當下時(shi)代(dai)的(de)空(kong)(kong)間(jian)(jian)轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)組技(ji)術(shu)(shu)提供了參考。

相比之下，在“前(qian)傳”之后的(de)(de)(de)(de)技(ji)(ji)術Lambda Moses和(he)(he)Lior Pachter將其(qi)稱之為“當(dang)前(qian)時(shi)代(dai)”。許多“當(dang)前(qian)時(shi)代(dai)”的(de)(de)(de)(de)技(ji)(ji)術的(de)(de)(de)(de)基礎都是在20世(shi)紀70年(nian)代(dai)到21世(shi)紀初的(de)(de)(de)(de)幾十年(nian)里建立(li)起來的(de)(de)(de)(de)。例如(ru)，微(wei)陣(zhen)(zhen)列(lie)(lie)技(ji)(ji)術于(yu)1995年(nian)首次報道[2]，最初用于(yu)量化(hua)與打(da)印在載玻片(pian)上的(de)(de)(de)(de)cDNA雜交的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)本(ben)，但很快(kuai)在1999年(nian)被用于(yu)量化(hua)LCM樣(yang)本(ben)的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)組[3]。當(dang)前(qian)流行(xing)的(de)(de)(de)(de)技(ji)(ji)術，如(ru)空間(jian)轉(zhuan)錄(lu)組學(xue)（ST）和(he)(he)10X Visium均依賴于(yu)這(zhe)種微(wei)陣(zhen)(zhen)列(lie)(lie)技(ji)(ji)術，可以從(cong)安裝在微(wei)陣(zhen)(zhen)列(lie)(lie)載玻片(pian)上的(de)(de)(de)(de)組織(zhi)中捕獲轉(zhuan)錄(lu)本(ben)。

近年(nian)來，空間(jian)轉(zhuan)錄組(zu)(zu)學(xue)技術(shu)(shu)經過了迅速發展，在分辨率和通量方面(mian)取得(de)了顯著提升，空間(jian)轉(zhuan)錄組(zu)(zu)也于2020年(nian)被(bei)《Nature Methods》評(ping)為年(nian)度(du)技術(shu)(shu)方法，同時在2022年(nian)被(bei)《Nature》雜志評(ping)選(xuan)為值得(de)關注的7大(da)年(nian)度(du)技術(shu)(shu)之(zhi)一。2023年(nian)空間(jian)組(zu)(zu)學(xue)再(zai)獲(huo)殊榮，成(cheng)為《World Economic Forum》評(ping)選(xuan)出的目前最有潛力、對世界產生(sheng)積極影響的十大(da)技術(shu)(shu)之(zhi)一。

圖2 空間轉錄組研究技(ji)術(shu)的發展

圖3 空(kong)間轉錄組技術近年所獲榮(rong)譽

空間(jian)轉錄(lu)組(zu)學(xue)的(de)概念最初源自(zi)FISH(fluorescently-labeled RNA sequences)，利用帶有熒光的(de)探針與目標結(jie)合(he)(he)來實(shi)現靶基(ji)(ji)因(yin)的(de)原(yuan)(yuan)位(wei)(wei)(wei)檢測(ce)(ce)(ce)，從(cong)而(er)實(shi)現對(dui)(dui)定(ding)性(xing)定(ding)量和(he)相對(dui)(dui)位(wei)(wei)(wei)置的(de)分析。根據原(yuan)(yuan)理的(de)不同，空間(jian)轉錄(lu)組(zu)技(ji)術可以分為基(ji)(ji)于(yu)成(cheng)像[4]和(he)基(ji)(ji)于(yu)測(ce)(ce)(ce)序(xu)[5]兩大類。基(ji)(ji)于(yu)成(cheng)像的(de)空間(jian)轉錄(lu)組(zu)技(ji)術主要通過顯微鏡觀察(cha)顯色(se)基(ji)(ji)團與探針結(jie)合(he)(he)后(hou)的(de)mRNA進(jin)行原(yuan)(yuan)位(wei)(wei)(wei)成(cheng)像。基(ji)(ji)于(yu)成(cheng)像的(de)空間(jian)轉錄(lu)組(zu)技(ji)術又能夠(gou)進(jin)一步(bu)分為原(yuan)(yuan)位(wei)(wei)(wei)雜交(jiao)（in situ hybridization, ISH）和(he)原(yuan)(yuan)位(wei)(wei)(wei)測(ce)(ce)(ce)序(xu)（in situ sequencing, ISS）。而(er)基(ji)(ji)于(yu)測(ce)(ce)(ce)序(xu)的(de)空間(jian)轉錄(lu)組(zu)技(ji)術則無需事先(xian)知道(dao)基(ji)(ji)因(yin)序(xu)列(lie)信息(xi)，它能夠(gou)從(cong)組(zu)織中提取mRNA并同時保留其空間(jian)位(wei)(wei)(wei)置信息(xi)，隨后(hou)通過高通量測(ce)(ce)(ce)序(xu)技(ji)術對(dui)(dui)mRNA進(jin)行檢測(ce)(ce)(ce)和(he)分析。

圖4 空間轉錄組技術(shu)原理(li)示(shi)意圖

基(ji)于(yu)(yu)(yu)原(yuan)位(wei)雜(za)(za)交(jiao)（ISH）的(de)(de)(de)(de)(de)(de)方法是(shi)一(yi)(yi)種(zhong)基(ji)于(yu)(yu)(yu)成像(xiang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)技(ji)(ji)(ji)術(shu)(shu)，其(qi)基(ji)礎是(shi)利用(yong)互補熒光(guang)探針與目標(biao)序(xu)列進(jin)行(xing)雜(za)(za)交(jiao)來進(jin)行(xing)檢測(ce)。2014年，加州理工學(xue)院的(de)(de)(de)(de)(de)(de)蔡龍教授開發出連續熒光(guang)原(yuan)位(wei)雜(za)(za)交(jiao)（sequential fluorescence in situ hybridization SeqFISH）技(ji)(ji)(ji)術(shu)(shu)[6]，該(gai)技(ji)(ji)(ji)術(shu)(shu)即(ji)為順序(xu)雜(za)(za)交(jiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)多重smFISH方法。通過4種(zhong)顏色，8輪雜(za)(za)交(jiao)（48=65536）足以編碼(ma)人類(lei)或小鼠(shu)基(ji)因(yin)組中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)所有基(ji)因(yin)。另一(yi)(yi)種(zhong)比較有代(dai)表性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)技(ji)(ji)(ji)術(shu)(shu)是(shi)MERFISH[7]，該(gai)技(ji)(ji)(ji)術(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)核心原(yuan)理是(shi)將mRNA和其(qi)他(ta)(ta)RNA分子定位(wei)于(yu)(yu)(yu)細胞中以便于(yu)(yu)(yu)檢測(ce)其(qi)表達水(shui)平，靶向探測(ce)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)過程分為兩個(ge)階段：熒光(guang)原(yuan)位(wei)雜(za)(za)交(jiao)和成像(xiang)分析(xi)。通過設計雜(za)(za)交(jiao)探針Panel，在設計時輸(shu)入(ru)我們關注的(de)(de)(de)(de)(de)(de)Marker基(ji)因(yin)，使得每一(yi)(yi)個(ge)RNA都被分配了一(yi)(yi)個(ge)唯一(yi)(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)二(er)進(jin)制條形(xing)碼(ma)。大多數其(qi)他(ta)(ta)基(ji)于(yu)(yu)(yu)smFISH的(de)(de)(de)(de)(de)(de)技(ji)(ji)(ji)術(shu)(shu)，如HybISS[8]和splitFISH[9]，也(ye)都是(shi)使用(yong)類(lei)似seqFISH或MERFISH的(de)(de)(de)(de)(de)(de)條形(xing)碼(ma)[10, 11]。

圖(tu)5 基于原位雜交的空間轉(zhuan)錄組典(dian)型(xing)技術原理示意圖(tu)

ISS方(fang)(fang)法(fa)(fa)通過(guo)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序產生(sheng)(sheng)空間轉(zhuan)錄(lu)組(zu)(zu)信息。具體(ti)而(er)言，該方(fang)(fang)法(fa)(fa)通過(guo)逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)RNA、滾動循(xun)環擴增(zeng)和(he)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序等(deng)步驟實現(xian)。Ke等(deng)人采(cai)用基(ji)(ji)于(yu)(yu)掛鎖探測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)，滾動環擴增(zeng)（RCA）和(he)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序連(lian)接化學的(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)(fa)，成(cheng)功研究了約50個靶(ba)向基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)在(zai)癌癥、結核病和(he)大腦發育中的(de)(de)表達(da)(da)情況[12]。STARMap則在(zai)此基(ji)(ji)礎上結合了水凝膠(jiao)化學的(de)(de)進展，改進了掛鎖和(he)引物的(de)(de)設計，實現(xian)以單(dan)細(xi)胞(bao)分(fen)辨率同時定位(wei)160到1020個基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)[13]。此外，原(yuan)位(wei)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序還具備(bei)非靶(ba)向分(fen)析的(de)(de)潛(qian)力。以FISSEQ為(wei)例，該方(fang)(fang)法(fa)(fa)利用隨機六聚(ju)體(ti)引物在(zai)固定細(xi)胞(bao)中逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)RNA，然后(hou)通過(guo)cDNA的(de)(de)環化生(sheng)(sheng)成(cheng)非靶(ba)向的(de)(de)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序文庫[14]。FISSEQ進一步提(ti)高了原(yuan)位(wei)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序技術的(de)(de)檢測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)通量(liang)，能夠獲(huo)得(de)包括基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)表達(da)(da)、RNA剪接和(he)轉(zhuan)錄(lu)后(hou)修飾(shi)等(deng)在(zai)內的(de)(de)全基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)級別(bie)的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)表達(da)(da)圖譜，并(bing)保留了它們的(de)(de)空間位(wei)置(zhi)信息。與單(dan)細(xi)胞(bao)RNA-seq相(xiang)比，FISSEQ對(dui)于(yu)(yu)功能重要的(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)本(ben)的(de)(de)富集(ji)程度更高，達(da)(da)到10倍以上，但其局限(xian)性在(zai)于(yu)(yu)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)得(de)的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)數(shu)目較少(shao)，測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序深度較低，從而(er)限(xian)制了其靈敏度。

圖(tu)6 基于原(yuan)位(wei)測序(xu)的空間(jian)轉錄組(zu)代表性技術原(yuan)理(li)示意圖(tu)

基(ji)于(yu)(yu)NGS的(de)(de)(de)方(fang)法(fa)(fa)(fa)源于(yu)(yu)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)RNA-Seq方(fang)法(fa)(fa)(fa)的(de)(de)(de)概念創新(xin)，在(zai)(zai)文庫準備之(zhi)前(qian)添加一(yi)個(ge)空(kong)(kong)間(jian)(jian)條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)[5]。2016年，瑞(rui)典(dian)皇(huang)家(jia)理工學(xue)院的(de)(de)(de)Joakim Lundeberg利用基(ji)因(yin)芯片(pian)(pian)技術(shu)開發了(le)(le)首個(ge)基(ji)于(yu)(yu)NGS的(de)(de)(de)空(kong)(kong)間(jian)(jian)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組(zu)學(xue)方(fang)法(fa)(fa)(fa)[15]。這(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)項(xiang)方(fang)法(fa)(fa)(fa)的(de)(de)(de)核(he)心創新(xin)在(zai)(zai)于(yu)(yu)，在(zai)(zai)逆轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)之(zhi)前(qian)，在(zai)(zai)空(kong)(kong)間(jian)(jian)條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)微陣列載玻(bo)片(pian)(pian)上捕獲多聚腺苷化(hua)RNA，以(yi)(yi)確保(bao)每個(ge)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)本可以(yi)(yi)通(tong)(tong)過(guo)獨特(te)(te)的(de)(de)(de)位(wei)置分(fen)(fen)子條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)映(ying)射回其(qi)原(yuan)(yuan)始點(dian)[16, 17]。2018年底，10×Genomics宣(xuan)布收(shou)購了(le)(le)這(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)項(xiang)技術(shu)，并于(yu)(yu)2019年發布了(le)(le)Visium空(kong)(kong)間(jian)(jian)基(ji)因(yin)表(biao)達(da)解決(jue)方(fang)案。Rodriques等(deng)人基(ji)于(yu)(yu)NGS技術(shu)發明了(le)(le)一(yi)種(zhong)名為Slide-Seq的(de)(de)(de)空(kong)(kong)間(jian)(jian)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組(zu)解決(jue)方(fang)案，該(gai)技術(shu)使(shi)用直徑為10 μm的(de)(de)(de)磁珠(zhu)覆蓋(gai)的(de)(de)(de)玻(bo)片(pian)(pian)，這(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)些磁珠(zhu)帶(dai)有已知的(de)(de)(de)barcode修(xiu)飾[18]。在(zai)(zai)這(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)個(ge)方(fang)法(fa)(fa)(fa)中，每個(ge)隨機(ji)條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)的(de)(de)(de)位(wei)置是通(tong)(tong)過(guo)原(yuan)(yuan)位(wei)索引(yin)獲得(de)(de)的(de)(de)(de)，實(shi)現(xian)了(le)(le)更高分(fen)(fen)辨(bian)率（10 μm），提高了(le)(le)靈敏(min)度（每個(ge)珠(zhu)子500個(ge)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)物）。Vickovic等(deng)人提出了(le)(le)一(yi)種(zhong)名為高分(fen)(fen)辨(bian)空(kong)(kong)間(jian)(jian)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組(zu)（HDST）測(ce)序(xu)方(fang)法(fa)(fa)(fa)[19]。該(gai)方(fang)法(fa)(fa)(fa)通(tong)(tong)過(guo)在(zai)(zai)載玻(bo)片(pian)(pian)表(biao)面(mian)(mian)雕刻(ke)大(da)量(liang)直徑為2 μm的(de)(de)(de)小孔(kong)，并將(jiang)直徑為2 μm的(de)(de)(de)硅(gui)膠(jiao)磁珠(zhu)分(fen)(fen)配到這(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)些孔(kong)中。通(tong)(tong)過(guo)在(zai)(zai)磁珠(zhu)表(biao)面(mian)(mian)連接帶(dai)有特(te)(te)定barcode序(xu)列、多種(zhong)唯一(yi)分(fen)(fen)子標(biao)識符（UMIs）和poly-dT的(de)(de)(de)寡核(he)苷酸鏈，可以(yi)(yi)捕獲對應位(wei)置細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)mRNA進(jin)行(xing)(xing)(xing)反(fan)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)，并進(jin)行(xing)(xing)(xing)文庫構建和轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組(zu)測(ce)序(xu)。DBiT-Seq方(fang)法(fa)(fa)(fa)采(cai)用了(le)(le)平行(xing)(xing)(xing)微流控通(tong)(tong)道(dao)將(jiang)DNA條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)傳遞到組(zu)織(zhi)(zhi)載玻(bo)片(pian)(pian)表(biao)面(mian)(mian)，將(jiang)兩組(zu)條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)A1-50和B1-50進(jin)行(xing)(xing)(xing)交叉流動(dong)，然(ran)后(hou)原(yuan)(yuan)位(wei)連接，得(de)(de)到組(zu)織(zhi)(zhi)像素(su)的(de)(de)(de)二(er)維(wei)馬賽(sai)克(ke)，每組(zu)都包(bao)含一(yi)個(ge)獨特(te)(te)的(de)(de)(de)完整條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)[20]。Stereo-seq則使(shi)用以(yi)(yi)陣列模式(shi)沉(chen)積的(de)(de)(de)隨機(ji)條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)DNA納米球，以(yi)(yi)實(shi)現(xian)納米級分(fen)(fen)辨(bian)率[21]。Seq-Scope使(shi)用基(ji)于(yu)(yu)Illumina合成測(ce)序(xu)平臺對隨機(ji)條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)單分(fen)(fen)子寡核(he)苷酸進(jin)行(xing)(xing)(xing)固相擴增，實(shi)現(xian)了(le)(le)亞細(xi)(xi)胞(bao)(bao)分(fen)(fen)辨(bian)率的(de)(de)(de)空(kong)(kong)間(jian)(jian)條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)，可用于(yu)(yu)可視化(hua)核(he)和細(xi)(xi)胞(bao)(bao)質(zhi)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)本[22]。Pixel-Seq采(cai)用了(le)(le)一(yi)種(zhong)創新(xin)的(de)(de)(de)方(fang)法(fa)(fa)(fa)，通(tong)(tong)過(guo)在(zai)(zai)定制的(de)(de)(de)凝膠(jiao)表(biao)面(mian)(mian)上排列“連續”的(de)(de)(de)polony寡聚物，改進(jin)了(le)(le)空(kong)(kong)間(jian)(jian)條(tiao)形(xing)碼(ma)(ma)方(fang)法(fa)(fa)(fa)，與現(xian)有方(fang)法(fa)(fa)(fa)相比，分(fen)(fen)辨(bian)率提高了(le)(le)200倍[23]。利用這(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)些技術(shu)，可以(yi)(yi)研(yan)究正常和疾(ji)病(bing)組(zu)織(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)組(zu)成及(ji)其(qi)與基(ji)因(yin)表(biao)達(da)的(de)(de)(de)關(guan)系(xi)，也可用于(yu)(yu)發現(xian)新(xin)的(de)(de)(de)組(zu)織(zhi)(zhi)生物標(biao)志物。

圖(tu)7 基于高(gao)通(tong)量(liang)測(ce)序(xu)的空間轉錄組(zu)代表性技術原理(li)示(shi)意(yi)圖(tu)

上述(shu)幾類(lei)空間轉錄組(zu)(zu)技術，需(xu)要對組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)進(jin)(jin)行切(qie)片，而組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)一旦切(qie)片，就無(wu)法獲得(de)完整單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)基(ji)因表(biao)達(da)信(xin)息(xi)，當(dang)前(qian)的(de)捕獲方法難以(yi)從單(dan)(dan)個細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)分(fen)(fen)離(li)出mRNA而不損(sun)害相鄰組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)。2014年(nian)，Lovatt等(deng)開(kai)發了一種(zhong)新的(de)空間轉錄組(zu)(zu)方法——TIVA[24]，第(di)一次非破壞(huai)性地從活細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)捕獲mRNA。該方法設(she)計了一種(zhong)光激活的(de)標(biao)簽(qian)（TIVA-tag），TIVA-tag包括一段(duan)poly（U）序列(lie)和兩個poly（A）片段(duan)，該標(biao)簽(qian)通過(guo)二硫鍵連接的(de)細(xi)胞(bao)(bao)穿透肽(tai)穿透細(xi)胞(bao)(bao)膜，以(yi)使TIVA-tag進(jin)(jin)入細(xi)胞(bao)(bao)，之(zhi)后在(zai)細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)進(jin)(jin)行光裂解(jie)，使得(de)poly（U）序列(lie)暴露出來，并與細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)mRNA的(de)poly（A）尾退火連接。組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)裂解(jie)后，用鏈(lian)霉素親和素和磁珠(zhu)純化得(de)到TIVA-tag-mRNA結(jie)合(he)產(chan)物。之(zhi)后，將(jiang)mRNA洗脫下來，進(jin)(jin)一步用于轉錄組(zu)(zu)分(fen)(fen)析(xi)。

圖8 TIVA技術原理(li)圖

空(kong)(kong)間(jian)(jian)(jian)轉錄(lu)組(zu)(zu)(zu)學(xue)在生命(ming)科學(xue)研究(jiu)中具有廣闊的(de)(de)(de)(de)應(ying)用(yong)前景和應(ying)用(yong)領域(yu)。由(you)于(yu)(yu)空(kong)(kong)間(jian)(jian)(jian)轉錄(lu)組(zu)(zu)(zu)技術(shu)提供了一個(ge)無偏的(de)(de)(de)(de)空(kong)(kong)間(jian)(jian)(jian)組(zu)(zu)(zu)成圖像，已被用(yong)于(yu)(yu)生成組(zu)(zu)(zu)織圖譜，作為參考提供了有價值的(de)(de)(de)(de)資源。它(ta)可以(yi)幫助(zhu)我們(men)了解組(zu)(zu)(zu)織發(fa)育和器官形成過(guo)程中基(ji)(ji)因(yin)表達的(de)(de)(de)(de)時(shi)空(kong)(kong)動態(tai)變化，揭示細(xi)胞(bao)類型(xing)和基(ji)(ji)因(yin)表達之(zhi)間(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)關系，以(yi)及(ji)相(xiang)鄰細(xi)胞(bao)之(zhi)間(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)相(xiang)互作用(yong)。此(ci)外，空(kong)(kong)間(jian)(jian)(jian)轉錄(lu)組(zu)(zu)(zu)學(xue)還可應(ying)用(yong)于(yu)(yu)疾病(bing)(bing)研究(jiu)，通過(guo)分析正常組(zu)(zu)(zu)織和疾病(bing)(bing)組(zu)(zu)(zu)織的(de)(de)(de)(de)空(kong)(kong)間(jian)(jian)(jian)轉錄(lu)組(zu)(zu)(zu)數(shu)據，深入理解疾病(bing)(bing)的(de)(de)(de)(de)發(fa)病(bing)(bing)機制，尋找新的(de)(de)(de)(de)治療靶點。

在神經生(sheng)物(wu)學方面(mian)(mian)：空(kong)間轉錄組(zu)學可以(yi)將腦(nao)細(xi)(xi)胞類型(xing)與形態學、生(sheng)理學和連(lian)接性相關(guan)的(de)功能學聯系(xi)起(qi)來，從而全面(mian)(mian)了解(jie)腦(nao)神經回(hui)路，系(xi)統地了解(jie)腦(nao)細(xi)(xi)胞類型(xing)及其在組(zu)織(zhi)中的(de)定(ding)位(wei)，并(bing)解(jie)析其工(gong)作機制。

在(zai)發育(yu)(yu)生(sheng)物學方面：空間(jian)轉錄組學圖譜(pu)可(ke)用于闡明心(xin)臟(zang)發育(yu)(yu)、精子發生(sheng)和腸道發育(yu)(yu)的(de)空間(jian)動力學，解析細胞的(de)分化軌跡和發育(yu)(yu)譜(pu)系及其在(zai)組織(zhi)中的(de)空間(jian)定(ding)位研究(jiu)組織(zhi)器官的(de)正常發育(yu)(yu)。

除了正(zheng)常的(de)(de)發育和生(sheng)(sheng)理(li)之外，空間(jian)轉錄組(zu)(zu)學(xue)很(hen)適合研究疾病中(zhong)的(de)(de)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)結構紊亂。例如，空間(jian)轉錄組(zu)(zu)學(xue)能夠(gou)識(shi)別在(zai)癌癥中(zhong)起作用的(de)(de)機制，即(ji)正(zheng)常生(sheng)(sheng)理(li)功能的(de)(de)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)結構發生(sheng)(sheng)改變(bian)。空間(jian)轉錄組(zu)(zu)學(xue)還為神(shen)經退(tui)行性(xing)疾病、感(gan)染(ran)和炎(yan)癥過程以及風濕病中(zhong)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)失調機制提供了見解。

總而言之，空(kong)(kong)間(jian)轉錄組學為我們提供了一(yi)種全新的(de)視(shi)角來(lai)研究基(ji)因表達和(he)細胞組成在(zai)空(kong)(kong)間(jian)維度上的(de)分布，對于理解生物系(xi)統的(de)復雜性和(he)疾(ji)病(bing)的(de)發生機(ji)制具有(you)重要意(yi)義，未來(lai)將在(zai)更多的(de)領(ling)域發揮作(zuo)用，并為生命(ming)科學研究帶來(lai)更多突破。

圖(tu)9 空間(jian)轉錄組學的應用(yong)

空間(jian)(jian)(jian)背景對(dui)推斷更深層次的(de)生物(wu)學意(yi)義的(de)重要(yao)性(xing)是毋庸置疑(yi)的(de)，但技術(shu)掣肘，例如敏感性(xing)、組織類(lei)型依(yi)賴性(xing)以及(ji)獲取(qu)詳細單(dan)細胞信(xin)息的(de)能力有限等(deng)使得(de)不同類(lei)型的(de)空間(jian)(jian)(jian)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組技術(shu)其應用場景也(ye)各不相同。下表對(dui)幾種(zhong)(zhong)代表性(xing)空間(jian)(jian)(jian)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組技術(shu)進(jin)行了(le)歸(gui)納，并從(cong)樣(yang)本(ben)類(lei)型、空間(jian)(jian)(jian)分辨(bian)率(lv)、靈敏度、細胞通量等(deng)角度將各種(zhong)(zhong)主流空間(jian)(jian)(jian)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組技術(shu)進(jin)行了(le)對(dui)比。

表(biao)1 主(zhu)流空間轉錄組技(ji)術對(dui)比

目(mu)前，空間轉(zhuan)錄(lu)組(zu)學面(mian)臨著(zhu)幾個挑戰(zhan)和(he)不足(zu)。

第(di)一，是在(zai)(zai)技(ji)(ji)術(shu)上(shang)的限制。當(dang)前的空間轉錄組(zu)(zu)學技(ji)(ji)術(shu)在(zai)(zai)精度(du)、靈敏度(du)和(he)(he)重復性(xing)等方面仍需要提(ti)高。這也使得仍然需要在(zai)(zai)數量(liang)(liang)和(he)(he)質量(liang)(liang)之間進行權衡(heng)。ST和(he)(he)Visium的分辨率(lv)(lv)有(you)限，檢測效(xiao)率(lv)(lv)低(di)，但更(geng)(geng)容(rong)易(yi)應(ying)用(yong)于(yu)(yu)(yu)大(da)面積的組(zu)(zu)織和(he)(he)全(quan)轉錄組(zu)(zu)。相(xiang)比之下，基(ji)于(yu)(yu)(yu)smFISH的技(ji)(ji)術(shu)具有(you)亞細胞分辨率(lv)(lv)，擁有(you)超過80%的檢測效(xiao)率(lv)(lv)，但當(dang)應(ying)用(yong)于(yu)(yu)(yu)10000個基(ji)因時效(xiao)率(lv)(lv)會降低(di)，而且(qie)更(geng)(geng)難(nan)應(ying)用(yong)于(yu)(yu)(yu)更(geng)(geng)大(da)的組(zu)(zu)織區域。由于(yu)(yu)(yu)仍然存在(zai)(zai)挑(tiao)戰(zhan)，收集數據(ju)的新技(ji)(ji)術(shu)也在(zai)(zai)不斷發(fa)展。

第二，與(yu)過去相比當下時代(dai)空轉技術更加精細(xi)化。雖然(ran)商業化的(de)(de)(de)(de)(de)LCM、ST和Visium已經傳(chuan)播得(de)非(fei)常廣泛，但基于(yu)smFISH的(de)(de)(de)(de)(de)各種高質量(liang)技術大多未能(neng)走出研發實驗室。這(zhe)可(ke)能(neng)是由(you)于(yu)構建自定義細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)困難以及針對(dui)不(bu)同組織(zhi)(zhi)定制(zhi)統一操(cao)作規程的(de)(de)(de)(de)(de)挑戰(zhan)，組織(zhi)(zhi)中的(de)(de)(de)(de)(de)不(bu)同細(xi)胞(bao)類型、狀態和位置的(de)(de)(de)(de)(de)差異(yi)，可(ke)能(neng)導致(zhi)不(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)基因表(biao)達(da)模式。如何處(chu)理這(zhe)種細(xi)胞(bao)異(yi)質性并精確地(di)識別不(bu)同細(xi)胞(bao)類型仍然(ran)是一個難題。需(xu)要開發更高級的(de)(de)(de)(de)(de)算(suan)法和技術來解決這(zhe)個問題，以獲得(de)更準確的(de)(de)(de)(de)(de)基因表(biao)達(da)圖譜，也(ye)有部分是因為(wei)缺乏統一的(de)(de)(de)(de)(de)、開源的(de)(de)(de)(de)(de)和文檔化的(de)(de)(de)(de)(de)軟(ruan)件平(ping)臺來處(chu)理數據。

總而言之，雖然(ran)空(kong)間轉錄(lu)組(zu)(zu)學(xue)在生(sheng)命科學(xue)研究中具(ju)有巨大潛(qian)力，但(dan)仍需要進一(yi)步改(gai)進技(ji)術(shu)和(he)方法，并解決當前(qian)的挑戰和(he)不足。隨著技(ji)術(shu)的不斷發(fa)展和(he)方法的改(gai)進，相信空(kong)間轉錄(lu)組(zu)(zu)學(xue)將(jiang)為(wei)我們提供更多有關基(ji)因(yin)表(biao)達和(he)細胞組(zu)(zu)成的寶貴(gui)信息，為(wei)生(sheng)命科學(xue)研究帶來更多突破(po)。