2017-03-31
派森諾生物與華東(dong)理(li)工大學合作(zuo)，應(ying)用宏基因組學的方(fang)法，挖掘棉花降解中新的糖苷(gan)水解酶代謝(xie)路徑，其研究(jiu)成果于(yu)2016年發表(biao)于(yu)《Journal of Biotechnology》上（影響(xiang)因子：2.667）。
1 研究背(bei)景
糖苷水(shui)解酶(mei)(mei)(mei)是(shi)水(shui)解酶(mei)(mei)(mei)家族中(zhong)的(de)一大類，隸屬(shu)于(yu)糖基(ji)(ji)酶(mei)(mei)(mei)，是(shi)所有可水(shui)解糖苷鍵的(de)酶(mei)(mei)(mei)類總(zong)稱。近(jin)年來，隨著糖類物(wu)質(zhi)(zhi)在生(sheng)物(wu)學領域內(nei)的(de)重(zhong)要性越(yue)(yue)發凸顯，關于(yu)糖苷酶(mei)(mei)(mei)的(de)研究(jiu)與應用(yong)也(ye)變(bian)得越(yue)(yue)發重(zhong)要。在工業生(sheng)產(chan)過程中(zhong)，需要更高性能的(de)糖苷水(shui)解酶(mei)(mei)(mei)，以(yi)便使生(sheng)物(wu)質(zhi)(zhi)原料有效的(de)降(jiang)解為可發酵糖類。本文通過宏基(ji)(ji)因組(zu)學方法結合基(ji)(ji)因克隆、蛋白表達(da)等手段，挖掘土壤微(wei)生(sheng)物(wu)群落中(zhong)，可以(yi)提高生(sheng)物(wu)質(zhi)(zhi)轉化和生(sheng)物(wu)制(zhi)品(pin)生(sheng)產(chan)的(de)新的(de)生(sheng)物(wu)質(zhi)(zhi)降(jiang)解酶(mei)(mei)(mei)。
2 研(yan)究方法
樣本(ben)來源：棉(mian)花種植地土壤樣本(ben)
測序平臺(tai)：Illumina MiSeq+HiSeq
首先通過MiSeq平臺分別(bie)測序(xu)細(xi)菌16S V4區(qu)以及真(zhen)菌ITS1區(qu)，獲(huo)取樣(yang)本(ben)中相應(ying)的菌群組成多樣(yang)性及豐度(du)等(deng)信息(xi)；然后(hou)利用HiSeq平臺對樣(yang)本(ben)進行宏基因(yin)組鳥槍法(fa)測序(xu)，并根據(ju)測序(xu)結果在CAZy數據(ju)庫(ku)中比對獲(huo)得(de)相應(ying)糖苷(gan)水解(jie)酶信息(xi)；最(zui)后(hou)通過基因(yin)克隆，蛋白(bai)表達以及酶活性測定等(deng)方式挖掘新的糖苷(gan)水解(jie)酶。
3 研究結果(guo)
3.1 土壤(rang)微(wei)生物群落組成分析(xi)
MiSeq平臺共產出57,883 條序列，根據97%相似度閾值歸并劃分出214個OTU，并發現在門水平優勢菌群為Proteobacteria（72%）、Bacteroidetes（17%）、Firmicutes（10%），其中Proteobacteria中以Gamma-Proteobacteria（41%）與Beta-Proteobacteria（26.1%）為主；Bacteroidetes中以Cytophagales（14.3%）為主；Firmicutes中以Bacillus（9.99%）為主。
利用MetaPhlAn構建菌群(qun)結構分(fen)(fen)(fen)類(lei)等級樹，以(yi)不同顏(yan)色區(qu)分(fen)(fen)(fen)各分(fen)(fen)(fen)類(lei)單元，并(bing)通過節(jie)點大小反映它(ta)們的(de)(de)豐度分(fen)(fen)(fen)布情況，從復(fu)雜的(de)(de)群(qun)落數據中快速(su)發(fa)現優勢的(de)(de)微生物類(lei)群(qun)。
3.2 宏(hong)基因(yin)組數據分析
HiSeq平臺共產出(chu)3.3Gb宏基因組數據，拼接組裝后的Contigs數據提(ti)交到(dao)MG-RAST進行(xing)分(fen)(fen)析；共406,305條序列通過質(zhi)量控制，并預測(ce)得(de)到(dao)321,789個蛋白編碼區進行(xing)后續分(fen)(fen)析；將這些蛋白通過BLASTX在CAZy數據庫中(zhong)進行(xing)比對(dui)，確定了32個主要的糖(tang)苷水解酶類家族成員(yuan)，包含2058個候選基因，其中(zhong)豐(feng)度高(gao)的三個家族為GH2、GH3以及(ji)GH43，并最終從這些基因中(zhong)挑選24個作為克隆(long)及(ji)蛋白表達分(fen)(fen)析。
32個(ge)主要的糖(tang)苷水解酶家族，共包含(han)2058個(ge)候選基(ji)因
3.3 糖苷水解(jie)酶基因的克隆(long)表(biao)達及(ji)特性研究
被選定的(de)(de)糖(tang)苷(gan)水解酶(mei)(mei)基因通(tong)過PCR擴增及克(ke)隆到表達載體的(de)(de)方式引入到大腸(chang)桿菌等(deng)宿主中進(jin)行蛋白表達，并(bing)對(dui)細(xi)胞(bao)裂解液進(jin)行SDS-PAGE電泳，后續(xu)進(jin)行酶(mei)(mei)活性(xing)檢測；最(zui)終挑選出16個(ge)在(zai)生(sheng)物質轉化及生(sheng)物制(zhi)品生(sheng)產中存在(zai)潛在(zai)應用價值(zhi)的(de)(de)糖(tang)苷(gan)水解酶(mei)(mei)基因克(ke)隆。
對(dui)于1GH_75-2，1GH_49以及1GH_368酶的(de)溫(wen)度和pH調查
4 研究結論(lun)
本研(yan)究(jiu)描(miao)述了(le)(le)從棉(mian)花種(zhong)植(zhi)地(di)土壤(rang)中鑒(jian)定的(de)微生(sheng)(sheng)(sheng)物群落參與粗棉(mian)生(sheng)(sheng)(sheng)物降解的(de)功能特性(xing)，通過(guo)宏基因(yin)組學的(de)研(yan)究(jiu)方法結合基因(yin)克隆、蛋白表達及酶活性(xing)測定等手(shou)段，成功篩(shai)選出16個在(zai)生(sheng)(sheng)(sheng)物質(zhi)轉化及生(sheng)(sheng)(sheng)物制(zhi)品(pin)生(sheng)(sheng)(sheng)產存在(zai)潛在(zai)應用價值的(de)糖苷(gan)水(shui)解酶類基因(yin)，為研(yan)究(jiu)生(sheng)(sheng)(sheng)物質(zhi)降解酶并結合生(sheng)(sheng)(sheng)產實際(ji)提供了(le)(le)理論基礎與研(yan)究(jiu)思路(lu)。
參考文獻
Zhang G, Liu P, Zhang L, et al. Bioprospecting metagenomics of a microbial community on cotton degradation: Mining for new glycoside hydrolases[J]. Journal of Biotechnology, 2016, 234:35-42.
