2016-09-12
派森(sen)諾生物(wu)與(yu)上海交通大學農業與(yu)生物(wu)學院、復旦大學生態與(yu)進化生物(wu)學系共(gong)同合作，在《BMC Microbiology》上發表(biao)論文(wen)，對天然(ran)冬蟲夏草的內生菌群(qun)及其關聯(lian)微環境進行了系統研究。
研究背景：
Ophiocordyceps sinensis （中(zhong)(zhong)文(wen)名叫(jiao)冬(dong)蟲(chong)(chong)夏草(cao)(cao)，DCXC），是一種由寄(ji)生真菌(jun)和(he)蟲(chong)(chong)共同構成(cheng)的(de)(de)(de)復(fu)合體，它具有(you)地域偏好性，主(zhu)要分布于(yu)西(xi)藏及(ji)周邊省份(fen)的(de)(de)(de)藏族自治區。作(zuo)為(wei)一種傳統名貴中(zhong)(zhong)藥，從天(tian)然(ran)蟲(chong)(chong)草(cao)(cao)中(zhong)(zhong)提取的(de)(de)(de)生物活(huo)性成(cheng)分具有(you)廣泛(fan)的(de)(de)(de)藥理作(zuo)用，比(bi)如抗炎(yan)癥、抗氧(yang)化、抗癌、較低血糖、抗細胞凋亡、免疫調(diao)節以及(ji)保肝保腎。由于(yu)天(tian)然(ran)蟲(chong)(chong)草(cao)(cao)的(de)(de)(de)藥用價值，導(dao)致(zhi)它被過度開采，瀕(bin)臨滅絕。在過去數十年里，科學家們(men)致(zhi)力于(yu)天(tian)然(ran)蟲(chong)(chong)草(cao)(cao)內源真菌(jun)的(de)(de)(de)分離鑒定，但僅通過傳統分離培養(yang)的(de)(de)(de)方法分析過有(you)限(xian)數量的(de)(de)(de)蟲(chong)(chong)草(cao)(cao)個體。隨著高(gao)通量測序技術的(de)(de)(de)飛(fei)速(su)發展(zhan)普及(ji)，研究天(tian)然(ran)蟲(chong)(chong)草(cao)(cao)的(de)(de)(de)菌(jun)群(qun)組成(cheng)、結構和(he)功能活(huo)性迫(po)在眉睫(jie)。
研究目的：
本研究(jiu)對(dui)天(tian)然蟲(chong)草(cao)(cao)進行分子普查，揭(jie)示其群落的(de)(de)組成、結構和(he)功(gong)能活性，為天(tian)然蟲(chong)草(cao)(cao)的(de)(de)遺(yi)傳多樣性及功(gong)能探究(jiu)奠定基礎，并為保護稀有(you)的(de)(de)天(tian)然蟲(chong)草(cao)(cao)提供(gong)可持(chi)續發展的(de)(de)生(sheng)物技(ji)術模型(xing)。
研究方法：
本(ben)研究從3個(ge)取樣位點分別(bie)(bie)采集5—10個(ge)天然蟲草，獲得子(zi)座（Stroma）和菌(jun)(jun)核（Sclerotia）兩個(ge)內生菌(jun)(jun)群樣本(ben)，以及外部皮層菌(jun)(jun)絲體（External mycelial cortices）和周邊土(tu)壤（Soil）兩個(ge)關聯微環(huan)境樣本(ben)，通過Roche 454 FLX+焦(jiao)磷(lin)酸測序(xu)(xu)技術，分別(bie)(bie)對細(xi)菌(jun)(jun)16S rRNA基(ji)因的(de)V1-V3可變區和真菌(jun)(jun)的(de)ITS區序(xu)(xu)列進行測序(xu)(xu)分析。
圖1 天然蟲(chong)草樣本(ben)采集信(xin)息
分析內容與結果說明：
1.蟲草內生菌群和關聯微環境的多樣性比較
在本研(yan)究(jiu)中(zhong)，通(tong)過對16S rRNA基因和(he)(he)ITS區(qu)的(de)(de)(de)(de)焦磷酸高通(tong)量測(ce)序(xu)，總(zong)獲(huo)得(de)44,588條(tiao)(tiao)細菌16S rRNA V1-V3可變(bian)區(qu)序(xu)列和(he)(he)51,584條(tiao)(tiao)真(zhen)菌ITS區(qu)序(xu)列，在97%的(de)(de)(de)(de)序(xu)列相似度下，分(fen)別歸并(bing)得(de)到14,975和(he)(he)9427個OTU。有意思的(de)(de)(de)(de)是(shi)，外部(bu)皮層菌絲體和(he)(he)周邊土壤兩個微環境中(zhong)的(de)(de)(de)(de)微生物多(duo)樣(yang)性(xing)，遠(yuan)遠(yuan)高于(yu)蟲(chong)草自(zi)身(shen)（子(zi)座和(he)(he)菌核(he)）的(de)(de)(de)(de)多(duo)樣(yang)性(xing)。
表(biao)1 天然蟲(chong)草內生菌(jun)群和關聯微環境的多樣性統計(ji)表(biao)
2.菌群類型不同，組成結構大相庭徑
將細菌和真菌群落分別與SILVA和UNITE數(shu)據庫(ku)進行比對發現(xian)，在門水平的細菌群落中，Proteobacteria是優(you)勢群落(luo)，在子(zi)座(zuo)、菌(jun)核、外(wai)部(bu)皮(pi)層(ceng)菌(jun)絲體和(he)(he)(he)周(zhou)邊(bian)土(tu)壤中(zhong)(zhong)，分(fen)別占(zhan)(zhan)68.4%、49.5%、38.9%和(he)(he)(he)35.6%；真菌(jun)群落(luo)中(zhong)(zhong)，Ascomycota為優(you)勢，在上述四個菌(jun)群中(zhong)(zhong)，分(fen)別占(zhan)(zhan)21.0%、45.6%、26.4%和(he)(he)(he)59.3%。 在屬(shu)水平的細(xi)菌(jun)群落(luo)中(zhong)(zhong)，Pseudomonas（9.24%）和(he)(he)(he)Rhodoferax（9.11%）在菌(jun)核中(zhong)(zhong)為優(you)勢，Pedobacter (8.05%)和(he)(he)(he)Rhodoferax (6.91%)的豐(feng)(feng)度在子(zi)座(zuo)中(zhong)(zhong)占(zhan)(zhan)據前兩(liang)位，而外(wai)部(bu)皮(pi)層(ceng)菌(jun)絲體中(zhong)(zhong)豐(feng)(feng)度高的是Thermomonas (3.43%)和(he)(he)(he)Gemmatimonas (2.13%)，周(zhou)邊(bian)土(tu)壤樣(yang)本中(zhong)(zhong)豐(feng)(feng)度高的是Ferruginibacter (3.07%)和(he)(he)(he)Gemmatimonas (2.22%)。
真菌(jun)群落中，Entoloma在菌(jun)核（2.62%）和外部皮層菌(jun)絲體（3.47%）中為(wei)優勢。在子(zi)座中，Exophiala (2.90%)、Cladophialophora (1.77%)和Phaeomollisia (1.45%)為(wei)優勢，而在土壤中，Cladophialophora (3.30%)和Verrucaria (3.10%)的豐度高居前兩位。
圖2 四個類型的細菌和真菌菌群在門水平的組成
3.不同類型群落間的相似性
通過PCoA主(zhu)坐標分析進(jin)一步發現，周邊土壤和外部(bu)皮(pi)層菌(jun)(jun)(jun)絲體中的(de)細菌(jun)(jun)(jun)群落更為相(xiang)似(si)(si)，并與子(zi)座和菌(jun)(jun)(jun)核群落差異(yi)明顯。對(dui)于真菌(jun)(jun)(jun)群落而言，菌(jun)(jun)(jun)核和外部(bu)皮(pi)層菌(jun)(jun)(jun)絲體之間的(de)菌(jun)(jun)(jun)群結構則更為相(xiang)似(si)(si)。
圖3 細菌與真菌群落的主坐標分析（PCoA）
4.樣品中細菌與真菌總豐度的定量驗證
最后(hou)，研究人(ren)員(yuan)通過熒光定量PCR的方法(fa)，比較了不(bu)同(tong)菌(jun)群(qun)類(lei)型中細菌(jun)和(he)真菌(jun)群(qun)落(luo)總量的高低。T檢驗表(biao)明(ming)，真菌(jun)群(qun)落(luo)的總量顯著高于細菌(jun)群(qun)落(luo)（P<0.05），同(tong)時，土壤群(qun)落(luo)中細菌(jun)和(he)真菌(jun)的總量均顯著高于其它類(lei)型的菌(jun)群(qun)（P<0.05）。
圖4 不同類型的(de)菌(jun)群中細(xi)菌(jun)和真(zhen)菌(jun)總(zong)量的(de)比(bi)較分析
研究結論：
本研究(jiu)通(tong)(tong)過454焦磷酸高(gao)通(tong)(tong)量測序的方法，對天然蟲草內(nei)生(sheng)菌群(qun)及其(qi)關聯微(wei)生(sheng)境的微(wei)生(sheng)物組成結構和(he)多樣性進(jin)行了系統的研究(jiu)，從而揭示了天然蟲草不同類型菌群(qun)中(zhong)的本質差異，并為(wei)從微(wei)生(sheng)態學角度解釋天然蟲草的具有(you)藥(yao)用價值提供了依(yi)據。也為(wei)自然界中(zhong)具有(you)生(sheng)物活性和(he)潛在藥(yao)用價值的其(qi)它天然物質提供了應用新思路。
原文索引：
Fei Xia, Yan Liu, Meng-Yuan Guo, Guang-Rong Shen, Juan Lin2 and Xuan-Wei Zhou. Pyrosequencing analysis revealed complex endogenetic microorganism community from natural DongChong XiaCao and its microhabitat. BMC Microbiology (2016) 16:196;doi10.1186/s12866-016-0813-5
