2016-06-13
本期我(wo)們以鴨疫里默氏桿(gan)菌（Riemerellaanatipestifer）Yb2為材料，學(xue)習如何借(jie)助Miseq平臺進(jin)行全基(ji)因組(zu)序(xu)列分析，鑒定毒力基(ji)因！該研究成果由(you)(you)中國(guo)科(ke)學(xue)院(yuan)上海獸(shou)醫(yi)研究所的(de)于圣青團隊(dui)在線發表在國(guo)際(ji)學(xue)術期刊《Applied and Environmental Microbiology》(IF:3.668)，其中測(ce)序(xu)和(he)分析工作由(you)(you)上海派(pai)森諾生(sheng)物科(ke)技股(gu)份(fen)有(you)限(xian)公司完成。
研究背景
鴨(ya)(ya)疫(yi)(yi)里(li)默氏(shi)桿菌(jun)是(shi)一種能(neng)夠(gou)引起(qi)雞(ji)、鴨(ya)(ya)、鵝等(deng)鳥類患流行性(xing)傳染性(xing)漿膜炎的(de)(de)(de)細菌(jun)，能(neng)夠(gou)給養鴨(ya)(ya)業帶來嚴重的(de)(de)(de)經濟損失。不同的(de)(de)(de)血清型和(he)菌(jun)株之(zhi)間毒力(li)變化(hua)很(hen)大(da)，目前除了毒力(li)因(yin)子(zi)VAPD，CAMP溶血素(su)和(he)外模蛋白的(de)(de)(de)相(xiang)關報(bao)道(dao)，其他關于鴨(ya)(ya)疫(yi)(yi)里(li)默氏(shi)桿菌(jun)致病(bing)的(de)(de)(de)分子(zi)基(ji)礎(chu)(chu)知識報(bao)道(dao)很(hen)少。本研究通(tong)過(guo)Miseq平臺(tai)完成了對(dui)鴨(ya)(ya)疫(yi)(yi)里(li)默氏(shi)桿菌(jun)Yb2的(de)(de)(de)全基(ji)因(yin)組序列(lie)分析，借(jie)助隨機轉座(zuo)子(zi)誘變和(he)體(ti)內篩選鑒定出49個毒力(li)基(ji)因(yin)，該(gai)數據對(dui)未來鴨(ya)(ya)疫(yi)(yi)里(li)默氏(shi)桿菌(jun)基(ji)礎(chu)(chu)發(fa)病(bing)機制的(de)(de)(de)研究提供遺傳基(ji)礎(chu)(chu)。
材料和方法
材料選取：
1、野生型鴨(ya)疫(yi)里(li)默氏桿(gan)菌Yb2
2、雛(chu)鴨(ya)（來自上海(hai)莊(zhuang)行鴨(ya)場）進行轉座子隨機突(tu)變和減毒突(tu)變體的分(fen)離(li)
測序平臺(tai)：Illumina MiSeq平臺(tai)
文庫(ku)：PE400和MP8K
分析內容
1、Yb2基(ji)因的預測和(he)注釋
2、Yb2基因組的進化分(fen)(fen)(fen)析：SNP分(fen)(fen)(fen)析；共線性(xing)分(fen)(fen)(fen)析；同源(yuan)性(xing)分(fen)(fen)(fen)析和系統(tong)發育樹重構
3、突(tu)變基因的鑒(jian)定(ding)和生物信息學分析
研究結果
1、鴨疫里默氏桿菌Yb2基因組特征
菌株Yb2有一(yi)個單一(yi)環狀的染色體，無證(zheng)據證(zheng)明質粒(li)的存(cun)在，預測(ce)有一(yi)個CRISPR序(xu)列，有七個假基因，2021個開放閱讀框（ORF），平均長度976bp。KEGG注(zhu)釋結果顯示，1217個ORFs被分(fen)到30不同(tong)的代謝(xie)途徑。
2、進化(hua)分析
對菌株DSM15868、RA-GD、RA-CH-1、RA-CH-2 和 Yb2 進行單核苷酸多態位點（SNP）、共線性和同源性分析發現RA-GD和(he)Yb2的(de)遺傳(chuan)距(ju)離近。
3、隨機轉座(zuo)子誘變和減毒突變株的(de)分離
通(tong)過(guo)(guo)Tn4351插入(ru)突變(bian)(bian)失活(huo)構(gou)建突變(bian)(bian)體庫，利用動物體內篩(shai)選(xuan)獲(huo)得(de)超過(guo)(guo)100倍(bei)衰減毒力的突變(bian)(bian)體，通(tong)過(guo)(guo)轉座子插入(ru)失活(huo)鑒定(ding)出49個毒力基因。
4、突變(bian)基因編碼蛋白的(de)生物信息學分析(xi)
通過PSORTb預測得到49個毒力基(ji)(ji)因編(bian)碼(ma)(ma)蛋白(bai)的(de)亞(ya)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)位(wei)置。其中，25個基(ji)(ji)因編(bian)碼(ma)(ma)產物為(wei)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)質蛋白(bai)，6個基(ji)(ji)因編(bian)碼(ma)(ma)產物為(wei)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)質膜(mo)蛋白(bai)，4個基(ji)(ji)因編(bian)碼(ma)(ma)產物為(wei)外膜(mo)蛋白(bai)，剩下的(de)14個基(ji)(ji)因編(bian)碼(ma)(ma)產物的(de)亞(ya)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)定(ding)位(wei)尚不清楚。
結果展示圖
圖1. Yb2基因組注(zhu)釋和GC偏移
圖2 鴨疫里默氏桿菌基因組序列示意圖總結通過轉座子隨機突變、體內篩選完成了鴨疫里默氏桿菌YB2的全基因組序列分析，鑒定出49個毒力基因，該研究為后續細菌鴨疫里默氏桿菌感染的耐藥性和持久性提供指導。
參考文獻：
Wang X, Ding C, Wang S, et al. Whole-Genome Sequence Analysis and Genome-Wide Virulence Gene Identification of Riemerellaanatipestifer Strain Yb2. Applied and Environmental Microbiology, 2015, 81(15): 5093-5102.
