2018-06-26
LncRNAs在心血(xue)管發育和心血(xue)管疾病的發生發展過程中起著重要(yao)的作用，參(can)與了細胞增(zeng)殖、肥(fei)大(da)和凋(diao)亡等(deng)過程，與動(dong)脈(mo)粥樣硬化(hua)、心肌梗死、心力衰竭等(deng)疾病密切相關(guan)。
目前(qian)尚未發現LncRNAs在擴張(zhang)型心肌病(bing)（DCM）方面的研(yan)究報(bao)道。
近日，華(hua)中(zhong)科(ke)技大學同(tong)濟醫學院(yuan)附(fu)屬同(tong)濟醫院(yuan)李華(hua)萍老(lao)師所(suo)在課題組結(jie)合(he)RNA-seq手段進行了DCM關聯病證(zheng)的(de)lncRNA挖掘，以期尋(xun)找(zhao)新(xin)的(de)藥(yao)物(wu)作用(yong)靶點，結(jie)果發表在Cardiovascular Research（IF=5.878）。
隨(sui)著基因測序技術的(de)(de)應(ying)用，在心血管領域將有(you)更多的(de)(de)特異性lncRNA被(bei)發現，其生理效應(ying)及病理機(ji)制將逐漸被(bei)揭示。
本期(qi)主角：RP11-544D21.2 and XLOC_014288?
[癥狀(zhuang)描述]充(chong)血性心力(li)衰竭為(wei)主，氣(qi)短和水(shui)腫(zhong)較常見
[疾病診斷]依據病史、臨床(chuang)表現(xian)及心電圖等(deng)檢查(cha)
[疾病(bing)原因]病(bing)毒感染(ran)、細胞免疫、家族(zu)遺傳、特發性(xing)
[流行病學]以中年人居多，男多于女(nv)
本文研究思路概述
第一(yi)步：表達譜測序(xu)（實驗組vs對照組有139個lncRNAs上(shang)調(diao)，174個lncRNAs下調(diao)）
第二步：qPCR驗證（TOP40差異lncRNAs中篩(shai)選出8個表(biao)達趨勢一致的lncRNAs）
第三步：假陽性篩查(cha)（通過不同(tong)數據庫功能(neng)交叉驗(yan)證(zheng)，最(zui)終得到4個(ge)可信的lncRNAs）
第四步：RNA-seq（對目標(biao)lncRNAs進(jin)行siRNA干擾，阻斷其表達，進(jin)行轉錄組(zu)測序）
Figure 1：實驗方案設計
Part1 表達譜(pu)測序結果分(fen)析
樣本分組：
Control：10例健康志(zhi)愿者(zhe)組織(zhi)樣本
Case：14例擴張型心肌病(bing)病(bing)人(ren)組(zu)織樣本(ben)
Table 1：測序樣本概況
對實(shi)驗組和(he)對照組表達(da)譜數據(ju)進行挖掘，根據(ju)p<0.05且|log2foldchange|>1的(de)差(cha)異基因篩(shai)選(xuan)標(biao)準，得到139個上調(diao)(diao)lncRNAs，174個下(xia)調(diao)(diao)lncRNAs；為(wei)了尋(xun)找(zhao)跟表型關(guan)聯緊密的(de)差(cha)異lncRNAs，我們又從(cong)中篩(shai)選(xuan)出TOP20的(de)上下(xia)調(diao)(diao)lncRNAs，作為(wei)后續驗證、尋(xun)找(zhao)關(guan)鍵(jian)lncRNA的(de)候選(xuan)對象。
經過NONCODE database數據庫篩(shai)查，其中(zhong)有10個被認(ren)為是(shi)心臟功(gong)能(neng)性相關的lncRNAs，隨后對其進行qPCR驗證，由(you)Figure 2D可知，驗證結果顯示一致性良好。
Figure 2：LncRNA profile in heart from 10 control and 14 DCM patients.
Part2 RNA-seq測序(xu)結(jie)果分析
前期準備
經過多數據庫交叉驗(yan)證，最終從驗(yan)證的差異lncRNAs中(zhong)篩選得到可信的兩(liang)個：RP11-544D21.2和XLOC_014288，并分別在六種組織器官中(zhong)進行表達水(shui)平檢測，選取U6 siRNA作為內參(can)，由Figure 3AB可知，RP11-544D21.2和XLOC_014288在各器官中(zhong)普遍都有(you)表達。
進一步在人心(xin)(xin)(xin)肌(ji)成纖維細胞(bao)(bao)（HCF）、人心(xin)(xin)(xin)肌(ji)細胞(bao)(bao)（HCM）、人心(xin)(xin)(xin)臟微(wei)血管內皮細胞(bao)(bao)（HCMEC)中分(fen)(fen)別(bie)驗證RP11-544D21.2和XLOC_014288的表(biao)達情況(kuang)，qPCR內參分(fen)(fen)別(bie)為COL1A1、TNT 、CD31，二者依舊顯(xian)現出寬(kuan)泛的區(qu)域表(biao)達特征。
上述(shu)結果表明，RP11-544D21.2和XLOC_014288可能(neng)作為多功能(neng)性lncRNA在擴張型心肌(ji)病的病理(li)過(guo)程中(zhong)發揮(hui)作用。
Figure 3：Tissue and cell distribution of identified lncRNAs.Relative expression levels of lncRNAs in different tissues after normalization to U6.
正式實驗（兩種靶向lncRNA+三種細胞樣本）
Control：未經lncRNA Smart Silence處理的細胞樣本
Case：特異性lncRNA Smart Silencer分別(bie)處(chu)理后(hou)的細胞樣本
人(ren)心肌(ji)成纖維細(xi)胞（HCF）+人(ren)心肌(ji)細(xi)胞（HCM）+人(ren)心臟微血(xue)管內(nei)皮細(xi)胞（HCMEC)
由于單(dan)獨的(de)(de)siRNA無法實現lncRNA的(de)(de)有效阻斷(duan)，本實驗選取了由三種siRNAs和三種反義(yi)寡核(he)苷酸(suan)組(zu)成(cheng)的(de)(de)混合體作為lncRNA Smart Silencer實現目標lncRNA的(de)(de)表(biao)達(da)阻斷(duan)。
對干(gan)擾后的(de)(de)細胞樣(yang)本(ben)進(jin)行RNA測序(xu)分析，并對每個樣(yang)本(ben)中TOP10的(de)(de)pathway進(jin)行差異(yi)基因富(fu)集分析，由Figure 4可見(jian)，RP11-544D21.2和XLOC_014288在不同(tong)(tong)樣(yang)本(ben)的(de)(de)不同(tong)(tong)代謝通路中發揮的(de)(de)功能也是(shi)多樣(yang)的(de)(de)。
Figure 4：Pathway analysis of lncRNAs in different cell types.
為(wei)了(le)進一步探究RP11-544D21.2和(he)XLOC_014288的(de)功(gong)能多效性(xing)作用(yong)機制(zhi)，利用(yong)TRANSFAC database數(shu)據庫進行了(le)lncRNA轉(zhuan)錄調控因子(zi)(zi)的(de)預(yu)測，并篩(shai)查得到一個跟DCM相關(guan)的(de)轉(zhuan)錄因子(zi)(zi)TFIID， TFIID是II型RNA聚合酶復合物前(qian)體的(de)一個組(zu)成(cheng)單元，一般由TAFs家族(zu)因子(zi)(zi)組(zu)合而(er)成(cheng)。
對TAFs進行定量檢測發現，相較于對照組，TAF10 和 TAF1C在DCM樣本中表達量上調；TAF1L、TAF5和TAF11在DCM樣本中表達量顯著下調。
借由以上實驗數據，可以窺見TFIID在充血性心力衰竭患者體內表達的不平衡性。相關性表達分析數據則表明，TAF10與四個DCM樣本中上調表達的lncRNAs均呈現良好的正相關。后續的CHIP-PCR實驗也證實TAF10與RP11-544D21.2有特異性結合位點。
Figure 5：Transcription factor for differently expressed lncRNAs.
結語
隨著現代生物學技術尤其是高通量(liang)測(ce)序技術在治(zhi)療(liao)心(xin)血(xue)管疾病(bing)研究中的(de)(de)應用，心(xin)血(xue)管疾病(bing)藥物證候相(xiang)關的(de)(de)lncRNA標志物將(jiang)被發現，lncRNA作為(wei)治(zhi)療(liao)心(xin)血(xue)管疾病(bing)新的(de)(de)作用靶點也將(jiang)被揭示。對闡明中藥治(zhi)療(liao)心(xin)血(xue)管疾病(bing)的(de)(de)分子機制(zhi)及新藥的(de)(de)開(kai)發將(jiang)具有(you)重(zhong)要意義。
