2018-08-07
研究背景
雌(ci)(ci)(ci)激(ji)素(su)是一(yi)(yi)種甾體激(ji)素(su)，對雌(ci)(ci)(ci)性繁殖有(you)廣泛的(de)影響。在生殖期，雌(ci)(ci)(ci)激(ji)素(su)的(de)合成主要在卵(luan)巢卵(luan)泡的(de)體細(xi)胞(bao)（卵(luan)泡膜細(xi)胞(bao)，TCs和顆粒細(xi)胞(bao)，GCs）中(zhong)。然(ran)而在哺乳(ru)動(dong)物(wu)和鳥(niao)類(lei)中(zhong)其合成位置并不相同(tong)。在哺乳(ru)動(dong)物(wu)中(zhong)，TCs從頭產(chan)生雄激(ji)素(su)，GCs進(jin)行雌(ci)(ci)(ci)二醇轉化。然(ran)而由于(yu)未知的(de)原(yuan)因，在鳥(niao)類(lei)中(zhong)TCs產(chan)生睪酮和雌(ci)(ci)(ci)二醇（一(yi)(yi)種雌(ci)(ci)(ci)激(ji)素(su)）。
CYP19A1編碼芳香酶，是(shi)負(fu)責雌(ci)激素(su)的(de)(de)生物合成的(de)(de)關鍵步驟。哺乳動(dong)物牛(niu)中，雌(ci)二醇在卵(luan)泡選(xuan)擇后的(de)(de)分化階段(duan)達(da)到高峰，而(er)在家禽雞中，CYP19A1 在選(xuan)擇階段(duan)的(de)(de)黃(huang)色小卵(luan)泡中達(da)到最高水平。目前，禽類的(de)(de)卵(luan)泡選(xuan)擇機(ji)制和兩(liang)種主(zhu)要細胞TCs,GCs在卵(luan)泡中的(de)(de)功能(neng)尚不清楚。而(er)哺乳動(dong)物牛(niu)的(de)(de)卵(luan)巢(chao)發(fa)育被很好的(de)(de)研(yan)究，因(yin)此通過比(bi)較轉錄組利用基因(yin)共(gong)表(biao)達(da)網絡分析（WGCNA）有(you)利于(yu)深入(ru)研(yan)究雞中卵(luan)巢(chao)發(fa)育機(ji)制。
WGCNA基本分析流程(cheng)：
1. 構建基因共表(biao)達網絡：使用加權的表(biao)達相關性。
2. 識別基(ji)因(yin)集：基(ji)于加權相關性，進行(xing)層級聚類分(fen)析，并(bing)根(gen)據設(she)定(ding)標準(zhun)切分(fen)聚類結(jie)果，獲得不同(tong)的(de)基(ji)因(yin)模塊，用(yong)聚類樹的(de)分(fen)枝和不同(tong)顏色(se)表(biao)示。
3. 如果有表型信息，計算基因模(mo)塊(kuai)(kuai)與表型的相(xiang)關性(xing)，鑒定性(xing)狀相(xiang)關的模(mo)塊(kuai)(kuai)。
4. 研究模(mo)塊之間的(de)關(guan)系(xi)，從系(xi)統層面(mian)查看不(bu)同模(mo)塊的(de)互作網絡。
5. 從關鍵(jian)模型中選擇(ze)感(gan)興趣(qu)的(de)關鍵(jian)基因(yin)，或(huo)根(gen)據模塊中已知基因(yin)的(de)功能(neng)(neng)推測未知基因(yin)的(de)功能(neng)(neng)。
研究方法
測序(xu)平臺：Illumina sequencing (Sequencing Mode: Paied-end, 2 ? 150 bp)
實驗對(dui)象 | 實驗材(cai)料 | 組(zu)名(ming) | 重復次(ci)數 |
雞 | 選擇前期：直徑6～8mm小(xiao)黃卵泡(pao)（樣品1,3,5,7用(yong)于顆粒(li)細(xi)胞；樣品2,4,6,8用(yong)于卵泡(pao)膜細(xi)胞） | chicken_SYF | 4+4 |
牛 （數據來源網絡） | 分化(hua)階段:LH出現(xian)前的卵(luan)泡期 | cow_D | 17 |
選(xuan)擇(ze)期(qi)：黃體期(qi)新(xin)選(xuan)擇(ze)的優勢卵泡 | cow_S |
研究結果
1、基(ji)因共(gong)表(biao)達網絡構建和模塊劃分
根(gen)據(ju)基因表(biao)(biao)達(da)加權(quan)相關性進行聚(ju)類分析，設置每個(ge)(ge)模(mo)(mo)塊中最(zui)少包(bao)含(han)30個(ge)(ge)基因， chicken_SYF形成23個(ge)(ge)模(mo)(mo)塊，cow_D 形成17 個(ge)(ge)模(mo)(mo)塊 ，cow_S形成18 個(ge)(ge)模(mo)(mo)塊。圖1為chicken_SYF模(mo)(mo)塊聚(ju)類樹，不同(tong)的(de)顏色代(dai)表(biao)(biao)不同(tong)的(de)模(mo)(mo)塊。
圖(tu)1 基因(yin)共表(biao)達網絡的可視化(hua)表(biao)示(shi)
2、chicken_SYF與(yu)牛分化期的卵泡網絡模塊高度相(xiang)似
利用基因(yin)重疊分別(bie)檢(jian)測chicken_SYF與(yu)cow_D和cow_S一致的模塊(kuai)，圖2-A顯示chicken_SYF（紅色線）與(yu)cow_D（藍色線）高度保守。 以CYP19A1基因(yin)表達為性(xing)(xing)狀(zhuang)，并將模塊(kuai)基因(yin)與(yu)該性(xing)(xing)狀(zhuang)的關聯通過量化來定義(yi)基因(yin)顯著(zhu)性(xing)(xing)（Gene Signi?cance，GS）。
圖(tu)2 物種間模塊相似(si)性(xing)和chicken_SYF模塊-性(xing)狀相關性(xing)
3、確定基因(yin)模塊(kuai)與性(xing)狀的關(guan)聯(lian)性(xing)
模(mo)塊(kuai)-性狀關系(xi)分析發現，兩個模(mo)塊(kuai)與(yu)CYP19A1基因表達顯著相(xiang)關：具有4588個注(zhu)釋(shi)基因的(de)天藍色模(mo)塊(kuai)（turquoise module）(r=?0.86, P=0.006)和具有1980個注(zhu)釋(shi)基因的(de)淡剛藍模(mo)塊(kuai)（lightsteelblue1 module ）(r=0.96, P=2E-04)。
圖3 chicken_SYF中(zhong)模塊-性(xing)狀(zhuang)相關性(xing)
4、關聯(lian)模塊中關鍵基因的功(gong)能分析
A1為(wei)(wei)天(tian)藍(lan)色模塊(kuai)(kuai)基(ji)因的網(wang)絡描述，A2為(wei)(wei)淡剛藍(lan)模塊(kuai)(kuai)基(ji)因的網(wang)絡描述，其中紅色表示關鍵(jian)基(ji)因。
圖4 雞模塊基因網絡及其(qi)功能分析
表(biao)1顯(xian)示天藍色模(mo)塊中(zhong)(zhong)(zhong)大多數基因(yin)(yin)(yin)參與基因(yin)(yin)(yin)的(de)轉錄調控（包(bao)括表(biao)觀遺傳調控）、細(xi)胞黏附以及雄(xiong)激素(su)和雌(ci)激素(su)受體信號通路。淡剛藍模(mo)塊中(zhong)(zhong)(zhong)大多數基因(yin)(yin)(yin)參與了基因(yin)(yin)(yin)轉錄調控以及蛋白質的(de)磷(lin)酸(suan)化和去磷(lin)酸(suan)化。這些(xie)關鍵基因(yin)(yin)(yin)中(zhong)(zhong)(zhong)包(bao)含兩個重要的(de)轉錄因(yin)(yin)(yin)子（ESR2, ALX1）。
表1 天藍色模塊和淡(dan)剛藍模塊中排名前10的關鍵基(ji)因
5、ESR2可能(neng)是調控CYP19A1基因的轉(zhuan)錄因子
之前研究表(biao)明(ming)CYP19A1在(zai)牛(niu)的(de)GCs中(zhong)表(biao)達(da)，而在(zai)雞的(de)TCs中(zhong)表(biao)達(da)。通過計算(suan)這兩個(ge)物(wu)種(zhong)GCs和(he)TCs中(zhong)差異表(biao)達(da)基因（DEGs），將(jiang)其與JASPAR網站預測轉錄(lu)因子(zi)(zi)進行比對，最終獲(huo)得(de)兩個(ge)可能(neng)的(de)轉錄(lu)因子(zi)(zi)ESR2和(he)Npase2（表(biao)2）。結(jie)合WGCNA分析得(de)到的(de)雞的(de)與CYP19A1表(biao)達(da)相關的(de)關鍵基因（表(biao)1）也包含ESR2，最終認為ESR2是CYP19A1潛在(zai)調(diao)控因子(zi)(zi)。
表2 通過JASPAR網(wang)站預(yu)測轉(zhuan)錄(lu)因子
6、RT-PCR檢測 ESR2和CYP19A1表(biao)達
雞(ji)中(zhong)(zhong)CYP19A1在小黃卵泡發(fa)育階段（TCs）達(da)(da)到表達(da)(da)高(gao)峰(feng)，并(bing)且在GCs中(zhong)(zhong)無表達(da)(da)（圖6-A）。ESR2在TCs中(zhong)(zhong)表達(da)(da)顯(xian)著高(gao)于(yu)GCs（圖6-B），實驗初步證明(ming)ESR2 與CYP19A1存在相關(guan)性(xing)。
圖6 雞(ji)中(zhong)(zhong)卵泡發育(yu)階段CYP19A1表(biao)達(da)模式和(he)小黃卵泡中(zhong)(zhong)關鍵(jian)基(ji)因表(biao)達(da)情況
7、雞中ESR2抑制CYP19A1基因表(biao)達
構建(jian)CYP19A1啟(qi)(qi)動子片(pian)段與熒光素酶融合表達載體，利用(yong)熒光素酶報告基因在293T（圖7-A）和DF-1(圖7-B)細胞中檢測CYP19A1啟(qi)(qi)動子片(pian)段（cp2-cp5）活性(xing)，發現其均具有(you)啟(qi)(qi)動子活性(xing)。
圖7 CYP19A1啟(qi)動子片段活性
在圖(tu)7的基礎上于293T細胞中分別將啟(qi)動子片段(duan)cp2與(yu)熒(ying)光(guang)(guang)素酶(mei)共表(biao)達(da)載體(ti)PGL3-cp2與(yu)不同濃(nong)度的ESR1表(biao)達(da)載體(ti)質(zhi)粒pcDNA-ESR1共轉(zhuan)發現熒(ying)光(guang)(guang)素酶(mei)活性顯著下降（圖(tu)8-A），不同CYP19A1啟(qi)動子片段(duan)的表(biao)達(da)載體(ti)與(yu)ESR1表(biao)達(da)載體(ti)質(zhi)粒pcDNA-ESR1共轉(zhuan)，發現ESR1可以降低(di)其熒(ying)光(guang)(guang)素酶(mei)活性。因此確定ESR1抑制CYP19A1表(biao)達(da)。
圖8 ESR2對CYP19A1啟動子片段(duan)活性的(de)影響
總結
1 物(wu)(wu)種(zhong)間相似(si)生物(wu)(wu)過(guo)程的(de)比較(jiao)(jiao)特(te)別是對一(yi)個研究(jiu)(jiu)較(jiao)(jiao)少(shao)的(de)物(wu)(wu)種(zhong)與一(yi)個研究(jiu)(jiu)的(de)較(jiao)(jiao)好物(wu)(wu)種(zhong)進行比較(jiao)(jiao)，不僅有(you)助于(yu)了解(jie)兩個物(wu)(wu)種(zhong)之(zhi)間的(de)進化保(bao)守性(xing)，而且還能為研究(jiu)(jiu)較(jiao)(jiao)少(shao)物(wu)(wu)種(zhong)的(de)特(te)定生物(wu)(wu)過(guo)程的(de)機制提(ti)供新的(de)見解(jie)。
2 該研(yan)究基(ji)于WGCNA比較牛和雞(ji)的卵(luan)(luan)泡(pao)選擇過(guo)程(cheng)。雞(ji)的小黃(huang)卵(luan)(luan)泡(pao)和牛卵(luan)(luan)泡(pao)分化階段之(zhi)間(jian)觀(guan)察到(dao)高度的種間(jian)模塊保守性(xing)。該結果將有助(zhu)于利(li)用牛卵(luan)(luan)泡(pao)發(fa)育信息(xi)了解雞(ji)卵(luan)(luan)泡(pao)的發(fa)育機制(zhi)。
3 “卵(luan)泡選擇(ze)(ze)”一詞用于哺(bu)乳動物和鳥類，這表(biao)明(ming)(ming)在(zai)不同物種中有相似(si)的(de)過程。結果表(biao)明(ming)(ming)，其發生在(zai)牛(niu)和雞(ji)的(de)不同階段。如圖(tu)9所示，牛(niu)卵(luan)泡選擇(ze)(ze)后的(de)分化階段實際上與(yu)雞(ji)的(de)小黃卵(luan)泡選擇(ze)(ze)階段相當。
圖9 雞(ji)和牛卵泡發育(yu)比較示意模型
4 該研究中(zhong)，在雞卵泡的(de)TCs中(zhong)確定了ESR2作為CYP19A1潛在的(de)調節因子(zi)，因為其與CYP19A1具有類似的(de)表達模式，并且雞中(zhong)ESR2直接抑制(zhi)CYP19A1的(de)表達。
文獻索引
Jing R, Gu L, Li J, et al. A transcriptomic comparison of theca and granulosa cells in chicken and cattle follicles reveals ESR2 as a potential regulator of CYP19A1 expression in the theca cells of chicken follicles[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics, 2018, 27: 40-53.
原文鏈(lian)接(jie)：//www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1744117X18300170?via%3Dihub=
